Для начала разогрейте препарированные головы комаров Anopheles в буфере CCD при температуре 37 градусов Цельсия на тепловом блоке в течение пяти минут. Перенесите трубку с головками комаров в печь для гибридизации для вращения при температуре 37 градусов Цельсия. Далее переложите все содержимое трубки в рассекаемое часовое стекло.
Щипцами возьмите в руки головки или любые оторвавшиеся усики и зафиксируйте их в одном миллилитре предфиксатора. В нутаторе вращайте головки в предфиксаторе в течение 24 часов при температуре четыре градуса Цельсия. Чтобы выполнить рассечение тканей, сначала промойте голову одним миллилитром 0,1% PBS-Tween на льду.
Затем переложите головки в рассекаемое часовое стекло. Под препарирующим микроскопом острыми щипцами извлеките из головы интересующие ткани. Возьмитесь щипцами за переднюю часть головы и возьмитесь за антенну другим щипцом от основания.
Аналогичным образом удалите пальпы. Перенесите усики и пальпы в пустые свободные от ДНК/РНК пробирки, помещенные на лед. Обезвоживайте ткань в 400 микролитрах обезвоживающего реагента в течение одного часа при комнатной температуре.
Затем замените дегидратирующий реагент на 400 микролитров абсолютного метанола и обезвоживайте ткани на ночь при температуре минус 20 градусов Цельсия. После завершения фиксации регидратируйте ткани в четырехступенчатой серии градуированных регидратационных растворов в течение 10 минут на льду. Затем простирайте салфетки в 400 микролитрах PBST в течение 10 минут при комнатной температуре.
Инкубируйте ткани в 400 микролитрах раствора протеиназы К в течение 30 минут при комнатной температуре. Промойте салфетки два раза в 400 микролитрах PBST, чтобы остановить ферментативное пищеварение. После добавления постфиксатора еще раз промойте ткань PBST перед гибридизацией зонда.
Погрузите ткань в 400 микролитров зондового гибридизационного буфера на пять минут. Далее удалите буфер и предварительно гибридизируйте ткань в 400 микролитрах предварительно нагретого зонда для гибридизационного буфера в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Замените предварительно нагретый буфер для гибридизации зонда на 400 микролитров нагретого раствора зонда.
Поместите трубку в нутатор на две ночи при температуре 37 градусов по Цельсию. Затем поместите нутатор внутрь инкубатора, накрытого коробкой. Далее обмотайте ткань в 400 микролитрах зонда в буфере при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе.
После промывки тканей в 5x SSCT инкубируйте в 400 микролитрах амплификационного буфера в течение 10 минут при комнатной температуре. Извлеките пипеткой буфер для усиления из пробирки. Затем добавьте смесь из нагретых шпилек, Н1 и Н2. Далее пипеткой насыпьте 100 микролитров амплификационного буфера.
Измельчите ткань на ночь в темноте при комнатной температуре. Чтобы закрепить ткань, сначала поместите пять капель монтажного раствора на предметное стекло. Далее щипцами захватите отмытые образцы тканей за их основание.
Аккуратно погрузите и промойте в ряд монтажный раствор капли. Затем закрепите монтажным раствором и наденьте на ткань чехол. Перед визуализацией заклейте покровное стекло лаком для ногтей.
Анализ обонятельной ткани самок комара Anopheles показал, что IR 41t1, IR75d и IR7t были менее распространены в усиках. IR64a был в три раза более распространен, чем остальные гены-кандидаты. Ко-локализация семейств рецепторов orco и IR25a наблюдалась в антенне, а также в верхнечелюстном щупле комара.
Паттерны колокализации позволяют предположить, что IR76b-положительные клетки экспрессируют IR25a, в то время как IR8a-положительные клетки частично колокализуются с IR76b и IR25a.