preparation and alignment of drosophila embryos for injecting fluorescently labeled antibodies

Antikor Aracılı Canlı Görüntüleme ile Protein Görselleştirmesinin Geliştirilmesi

Immunofluorescence is a cornerstone technique of modern cell biology originally developed by Albert Coons, which enables the detection of molecules at their native cellular compartments and characterization of the molecular compositions of subcellular organelles or machineries1. Coupled with genetic manipulations, immunofluorescence helps establish the now well-accepted concept that protein localization is essential for its function2. Aside from specific primary antibodies and bright fluorescent dyes, the success of this technique relies on a preliminary process named fixation and permeabilization, which preserves cellular morphologies, immobilizes antigens, and increases the accessibility of antibodies into intracellular compartments. Inevitably, the fixation and permeabilization process would kill cells and terminate all biological processes3. Therefore, immunofluorescence only provides snapshots of the life journey of proteins. However, many biological processes such as cell migration and divisions are dynamic in nature, requiring investigation of protein behaviors in a spatial-temporally resolved manner4,5.
To examine protein dynamics in living organisms, live imaging methods based on genetically encoded fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP)6 and high-speed confocal microscopes have been developed. Briefly, the protein of interest can be genetically manipulated to be fused with GFP7, and then ectopically expressed from viral or yeast promoters such as cytomegalovirus (CMV)8 or upstream activation sequence (UAS)9. Because GFP is autofluorescent in nature, no fluorophore-coupled antibodies are required to reveal the localization of target proteins, which bypasses the necessity of preliminary processes of fixation or permeabilization. Over the last two decades, fluorescent tags spanning the whole spectrum of wavelength have been developed10, enabling multi-color live imaging of several target proteins at the same time. However, compared to chemically engineered fluorescent dyes such as AlexaFluor or ATTO, the autofluorescence of these genetically encoded fluorescent proteins is relatively weak and unstable when expressed from endogenous promoters, especially during live imaging over longer time scales10. While this shortfall can be mitigated by over-expressing fluorescently tagged target proteins, many with enzymatic activities such as kinases and phosphatases severely disrupt normal biological processes if not expressed at physiological levels.
This protocol presents a method that enables photostable antibody-based target illumination in a live image setup, essentially allowing immunofluorescence without the process of fixation or permeabilization (Figure 1). Through a simple NHS-based primary amine reaction11, one can conjugate fluorescent dyes such as AlexaFluor 488 or 594 with essentially any primary antibody or GFP/HA/Myc nanobody12. Taking advantage of a developmental feature that all Drosophila embryonic cells share a common cytoplasm during the syncytium stage13, one can achieve antigen binding and illumination across entire embryos after the injection of dye-conjugated antibodies. With expanding libraries of endogenously tagged proteins available in Drosophila and other model systems14, this method can potentially broaden applications of these libraries by revealing dynamics of low-abundance fluorescently tagged proteins and other non-fluorescently tagged (HA/Myc-tagged) proteins in living tissues.

Yazar Gündemi: Hayvan Morfogenez Araştırmalarında Mekanik ve Biyokimyasal Sinyallerin Dinamiklerini Ortaya Çıkarmak 

Floresan Antikor Enjeksiyonu ile Canlı Drosophila Embriyolarında Düşük Bolluktaki Proteinlerin ve Translasyon Sonrası Modifikasyonların Görselleştirilmesi

We aim to understand how mechanical and biochemical signals correlate animal morphogenesis, including the detection and the response to forces by cells and molecules. More molecules have been discovered to be mechanosensitive, functioning differently under varying levels of tension. However, the physiological context and the function of these force-sensitive events remain largely unknown.Due to the dynamic nature of force-sensitive events, our field largely relies on high-speed fluorescence imaging and time-lapse recording to capture molecular and cellular behaviors. Many fluorescently-tagged proteins are not bright enough to be imaged, and it requires spatial-temporal resolution without significant bleach. On the other hand, traditional immunofluorescence methods can only capture a snapshot of molecular and cellular fixture after fixation.This method paves the way to dynamically track the localization of many low-abundance protein receptors of major signaling pathways, such as Notch, Wnt, and the BMP pathways. Eventually, in addition to the traditional linear signaling cascades, we can pinpoint and where the signaling events occur at the subcellular scales.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Alignment of Drosophila  Embryos for Injecting Fluorescently Labeled Antibodies at JoVE.com

Preparation and Alignment of Drosophila  Embryos for Injecting Fluorescently Labeled Antibodies  

Floresan Etiketli Antikorların Enjekte Edilmesi için Drosophila Embriyolarının Hazırlanması ve Hizalanması

Başlamak için, yumurtadan yeni çıkmış 200 yetişkin drosophila'yı plastik silindir şeklindeki bir kafese yerleştirin. Kafesin bir tarafını havalandırma için gözenekli metal ağla, diğer tarafını meyve suyu ve maya macunu agar plakasıyla kapatın. Enjeksiyon gününde, kafesin agar plakasını minimum maya ezmesi içeren bir meyve suyu plakası ile değiştirin.Embriyoları toplamak için plakayı bir saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra yumurtlamayı durdurmak için plakayı kafesten çıkarın ve iki ila üç saatlik embriyolar elde etmek için iki saat daha 25 santigrat derecede inkübe edin. Yumurta kabuğunu embriyolardan çıkarmak için, meyve suyu tabağına iki mililitre% 50 ağartıcı solüsyon ekleyin.Bir boya fırçası kullanarak, embriyoları plakadan nazikçe çıkarın ve yumurta kabuğu çıkarma verimliliğini artırmak için her 30 saniyede bir döndürürken plakayı iki dakika inkübe edin. Daha sonra embriyo ve ağartıcı karışımını 70 mikrometrelik bir naylon hücre süzgecine dökün. Kalan ağartıcı ve maya macununu ortadan kaldırmak için embriyoları bir su şişesiyle kapsamlı bir şekilde durulayın.Temiz bir tıraş bıçağı kullanarak dikdörtgen bir agaroz bloğu kesin ve bloğu bir cam slayt üzerine yerleştirin. Bir boya fırçası ile embriyoları süzgeçten jel bloğa aktarın ve nazikçe fırçalayarak bloğun orta çizgisi boyunca eşit olarak dağıtın. Şimdi, tek bir keskin nokta oluşturmak için iki bacağı güvenli bir şekilde bantlanmış bir cımbız hazırlayın.Diseksiyon mikroskobu altında, cımbız kullanarak tek tek embriyoları seçin ve bunları jel bloğunun uzatılmış kenarı boyunca hizalayın. 24 x 50 milimetrelik bir kapak kaymasının orta noktasına 10 mikrolitre heptan yapıştırıcı pipetleyin. Yapıştırıcıyı 0,5 x üç santimetre dikdörtgen bir alana yaymak için bir pipet ucu kullanın.Düz uçlu bir cımbız kullanarak, tutkal kaplı kapak kızağını kaldırın ve tutkal tarafının embriyolara yaklaşık 45 derecede bakmasını sağlayarak embriyoların üzerinde sabit bir şekilde tutun. Kapak fişini jel bloğa hafifçe bastırarak embriyoların yapıştırıcıya dokunmasına izin verin. Basıncı hızla boşaltın ve kapak kızağını yükseltin.Ardından taze bir cam slaydın ortasına 10 mikrolitre su dağıtın. Embriyo taşıyan kapak kızağını, embriyo tarafının yukarı bakmasını sağlayacak şekilde üzerine yerleştirin. Daha sonra, embriyo şeridinin bir ucuna 40 mikrolitre halo karbon yağı uygulayın.Halo karbon yağı embriyonun yüzeyini kaplayana kadar slaytı açın.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation and Alignment of Drosophila Embryos for Injecting Fluorescently Labeled Antibodies

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

Gelişim Biyolojisi

Fluorescent Labeling of Antibodies for Imaging Low Abundance Proteins in Drosophila

Fluorescent Labeling of Antibodies for Imaging Low Abundance Proteins in  Drosophila   

Drosophila'da Düşük Bolluktaki Proteinleri Görüntülemek için Antikorların Floresan Etiketlemesi

Injecting Fluorescently Labeled Antibodies in Live Drosophila Embryos and Imaging of Low Abundance Proteins

Injecting Fluorescently Labeled Antibodies in Live Drosophila  Embryos and Imaging of Low Abundance Proteins  

Canlı Drosophila Embriyolarına Floresan Etiketli Antikorların Enjekte Edilmesi ve Düşük Bolluklu Proteinlerin Görüntülenmesi