まず、HEPES Buffered E3培地またはE3を含む1.8%アガロースプレートを調製します。解剖顕微鏡下で作業しながら、麻酔をかけた幼虫を6〜10匹アガロースプレートに一列に並べます。各幼虫の頭に昆虫ピンを1つ置きます。次に、ティッシュを使用して残りのE3をプレートから取り出します。
別の昆虫ピンを使用して、他の臓器を乱すことなく幼虫から腸を分離します。卵黄を適切に除去してください。分離したら、腸を検査し、皮膚、脂肪、肝臓などの腸以外の物質をすべて取り除きます。
ピンセットを使用して腸を採取し、氷上に置いた微量遠心チューブで10%FCSを含むPBSに移します。すべての腸を解剖した直後に、微量遠心チューブを13, 800 gで30秒間遠心分離します。上澄み液を取り除き、腸が乾燥するのを防ぐためにチューブに約100マイクロリットルを残します。
チューブ内の腸に500マイクロリットルのパパイン溶液を追加します。2.5マイクロリットルの1モルシステインを添加してパパインを活性化します。次に、腸を含むチューブを摂氏37度の水浴で10分間インキュベートします。
5分後に内容物をピペットで上下に動かし、酵素組織消化を刺激します。解離した細胞を、あらかじめ結合した35ミクロンのセルストレーナーを介して、蛍光活性化セルソーティング(FACS)チューブに移します。総洗浄量2ミリリットルに10%FCSを含むPBS0.5ミリリットルを加えて、ストレーナを数回洗浄します。
回収した濾液を700g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去する。10%FCSを含む300マイクロリットルのPBSに、1ミリリットルのDAPIあたり1マイクログラムを添加する。この混合物をペレットに加え、再懸濁して死細胞を標識します。
その後、氷上で5分間インキュベートし、その後のFACS分析中にそれらを除外できるようにします。