Name: FACS Enrichment of Zebrafish Gut Cell Suspension for scRNAseq
Uploaded: 2023-11-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FACS Enrichment of Zebrafish Gut Cell Suspension for scRNAseq at JoVE.com

facs enrichment of zebrafish gut cell suspension for scrnaseq

עיבוד תאי מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

The gastrointestinal (GI) tract is a complex system that plays a vital role in overall health and well-being. It is responsible for the digestion and absorption of nutrients, as well as the elimination of waste products1,2. The GI tract is composed of multiple cell types, including epithelial cells, smooth muscle cells, immune cells, and the enteric nervous system (ENS), which communicate closely together to regulate and maintain proper intestinal function3,4,5. Defects in the development of the GI tract can have far-reaching effects on various aspects such as nutrient absorption, microbiota composition, the gut-brain axis, and the ENS, leading to several enteric neuromuscular disorders, such as Hirschsprung disease and Chronic intestinal pseudo-obstruction6,7. These disorders are characterized by severe gut dysmotility caused by alterations in various key cells, such as the interstitial cells of Cajal, smooth muscle cells, and the ENS6,8,9. However, the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction are still poorly understood.
The zebrafish is a valuable model organism for studying GI development and dysfunction due to its rapid embryonic development, transparency during embryonic and larval stages, and genetic tractability10,11,12,13,14. Numerous transgenic zebrafish lines expressing fluorescent proteins are available. An example of such a line is the tg(phox2bb:GFP) zebrafish, commonly used to study the ENS, as all phox2bb+ cells, including enteric neurons, are labeled15,16. Here, using the tg(phox2bb:GFP) zebrafish line, we present a method for intestinal isolation of 5 days post fertilization (dpf) larvae for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis (Figure 1).

מחבר זרקור: בידוד וניתוח תאי מעיים של זחלי דגי זברה לחקר היבטים שעתוק של התפתחות מערכת העיכול 

בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

Our research aims to investigate the transcriptomic changes occurring during gastrointestinal development and dysfunction in zebrafish larvae. Here, we provide a new protocol that allows isolation of different cell types within the zebrafish intestine, which has potential applications in understanding gastrointestinal health and disease. In recent years, there has been growing interest in exploring the interaction between the enteric nervous system and other intestinal cell types during development and disease.Understanding these complex dynamics using advanced techniques like single-cell RNA sequencing, holds the potential to reveal critical insights into enteric neuromyopathies, leading to more precise diagnostics and treatments. Using this protocol, we successfully identified various intestinal cell types, including epithelial, stromal, bloods, muscle, immune cells, and even enteric neurons and glia, which have not been captured before at this amount using similar approaches. Thus, we provide a reliable technique to study the gastrointestinal composition during development and dysfunction.

Watch this Scientific Journal Video about FACS Enrichment of Zebrafish Gut Cell Suspension for scRNAseq at JoVE.com

FACS Enrichment of Zebrafish Gut Cell Suspension for scRNAseq  

FACS העשרת תרחיף תאי מעיים של דגי זברה עבור scRNAseq

כדי לבצע מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, או FACS, על תאי המעי שבודדו מזחלי דגי זברה, השתמש בדגימת הזחלים השלמים מסוג בר כדי לקבוע את שערי אוכלוסיית התאים הממוינת על ידי רישום 3, 000 תאים על ציטומטר הזרימה. השתמש בפייה של 100 מיקרון והגדר את דיוק המיון לטוהר של 4 כיוונים. שים את צינור האיסוף המכיל 200 מיקרוליטר PBS עם 5% נסיוב עגל עוברי במכשיר הפקס.העמיסו את תרחיף התאים שהוכן מהמעיים המבודדים, ולאחר הרחקת תאים כפולים בתאים מתים, מינו תאים בודדים חיים או שליליים לצינור האיסוף. שמור את צינור האיסוף על קרח לאחר מיון תאים, באמצעות בדיקת כדאיות עם כחול טריפאן. לספור את מספר התאים בהשעיה עם המוציטומטר.התאים מוכנים כעת לעיבוד עבור ריצוף RNA של תא יחיד. השתמש בכ- 20, 000 תאים לכל דגימה.

Research