For at udvikle en LC-TIMS ToF MS / MS-metode til analyse af proteolytiske histonpeptider skal du koble en HPLC udstyret med en C-18-søjle med et kommercielt TIMS ToF MS-instrument med proprietær passiv teknologi. Indstil derefter driftsbetingelserne for nanoelektrosprayionisering til 4.500 volt kapillærspænding, 800 volt endepladeforskydning, tre bar forstøvertryk, 10 liter pr. Minut tør gas og 200 grader celsius tørvarmer. Konfigurer MS-indstillingerne til seks elektronvolt kollisionsenergi, 1200 VPP kollision RF, 75 mikrosekunder overførselstid og fem mikrosekunder før pulslagring.
Juster injektionsvolumenet til 20 mikroliter, svarende til otte mikrogram af prøven, og indstil strømningshastigheden til 0,4 ml pr. Minut. Når du har indtastet den angivne gradienttidslinje og acetonidforsøg med 0,1 % myresyreprocenter, skal du vælge okay i begge pop op-bokse for at gemme metoden. Kør en 60 minutters ikke-lineær LC-gradient med vand og acetonitril, begge med 0,1% myresyre.
Kontroller prøveeluering fra HPLC til TIMS ToF via nanoelektrosprayionisering i positiv ioniseringstilstand. For at identificere peptidsekvenser og modifikationssteder under MS-Digest-værktøjet skal du generere en teoretisk liste over peptider ved hjælp af Protein Prospector. Udfør derefter en teoretisk fordøjelse i betragtning af fordøjelsesbetingelserne, typen af posttranslationelle modifikationer, peptidstørrelsesområde, massedetekteringsområde og det potentielle antal ubesvarede spaltninger.
For at analysere de erhvervede data skal du søge efter masserne ved flere ladningstilstande, der spænder fra plus en til plus fire, for hvert teoretisk peptid. Når du har identificeret hvert masse-til-ladningsforhold, skal du vælge toppen og bekræfte MSMS ved hjælp af en teoretisk liste over fragmenteringsioner baseret på peptidsekvensen. Herunder posttranslationelle ændringer.
Fragmenteringsspektre af peptiderne afslørede tre forskellige peptidvarianter med forskellige posttranskriptionelle modifikationer, herunder propionyl- og acetylgrupper, i forskellige positioner. Den propionylerede histon H3-standard udviste længere peptider end den umodificerede version. Histoner ekstraheret fra HeLa S3-celler viste flere posttranslationelle modifikationsmønstre ved de samme aminosyrepositioner.