Um eine LC-TIMS ToF MS/MS-Methode zur Analyse proteolytischer Histonpeptide zu entwickeln, koppeln Sie eine HPLC mit einer C-18-Säule mit einem kommerziellen TIMS ToF MS-Gerät mit proprietärer passiver Technologie. Stellen Sie als Nächstes die Betriebsbedingungen für die Nanoelektrospray-Ionisation auf 4.500 Volt Kapillarspannung, 800 Volt Endplattenversatz, drei bar Verneblerdruck, 10 Liter Trockengas pro Minute und 200 Grad Celsius Trockenheizung ein. Konfigurieren Sie die MS-Einstellungen auf sechs Elektronenvolt Kollisionsenergie, 1200 VPP Kollisions-HF, 75 Mikrosekunden Übertragungszeit und fünf Mikrosekunden Vorimpulsspeicherung.
Stellen Sie das Injektionsvolumen auf 20 Mikroliter ein, was acht Mikrogramm der Probe entspricht, und stellen Sie die Durchflussrate auf 0,4 Milliliter pro Minute ein. Nachdem Sie die angegebene Gradientenzeitleiste und den Acetonidversuch mit 0,1 % Ameisensäureanteil eingegeben haben, wählen Sie in beiden Popup-Feldern OK aus, um die Methode zu speichern. Führen Sie einen 60-minütigen nichtlinearen LC-Gradienten mit Wasser und Acetonitril, beide mit 0,1 % Ameisensäure, durch.
Überprüfen Sie die Probenelution von der HPLC in das TIMS ToF durch Nanoelektrospray-Ionisation im positiven Ionisationsmodus. Um Peptidsequenzen und Modifikationsstellen mit dem MS-Digest-Tool zu identifizieren, erstellen Sie mit Protein Prospector eine theoretische Liste von Peptiden. Führen Sie dann einen theoretischen Verdau unter Berücksichtigung der Verdaubedingungen, der Art der posttranslationalen Modifikationen, des Peptidgrößenbereichs, des Massennachweisbereichs und der potenziellen Anzahl verpasster Spaltungen durch.
Um die erfassten Daten zu analysieren, suchen Sie nach den Massen bei mehreren Ladungszuständen, die von plus eins bis plus vier reichen, für jedes theoretische Peptid. Nachdem Sie jedes Verhältnis von Masse zu Ladung identifiziert haben, wählen Sie den Peak aus und bestätigen Sie das MSMS mit einer theoretischen Liste von Fragmentierungsionen basierend auf der Peptidsequenz. Einschließlich posttranslationaler Modifikationen.
Fragmentierungsspektren der Peptide zeigten drei verschiedene Peptidvarianten mit verschiedenen posttranskriptionellen Modifikationen, einschließlich Propionyl- und Acetylgruppen, an verschiedenen Positionen. Der propionylierte Histon-H3-Standard wies längere Peptide auf als die unmodifizierte Version. Histone, die aus HeLa S3-Zellen extrahiert wurden, zeigten mehrere posttranslationale Modifikationsmuster an denselben Aminosäurepositionen.