Чтобы разработать метод LC-TIMS ToF MS/MS для анализа протеолитических пептидов гистонов, соедините ВЭЖХ, оснащенный колонкой C-18, с коммерческим прибором TIMS ToF MS с запатентованной пассивной технологией. Затем установите рабочие условия ионизации наноэлектрораспыления на 4, капиллярное напряжение 500 вольт, смещение торцевой пластины 800 вольт, давление небулайзера три бара, сухой газ 10 литров в минуту и сухой нагреватель 200 градусов Цельсия. Настройте параметры MS на шесть электрон-вольтовых энергий столкновения, 1200 VPP на РЧ-сигнал, время передачи 75 микросекунд и пять микросекунд на хранение предимпульсных импульсов.
Отрегулируйте объем впрыска до 20 микролитров, что соответствует восьми микрограммам образца, и установите скорость потока на 0,4 миллилитра в минуту. После ввода указанной временной шкалы градиента и испытания ацетонида с процентным содержанием муравьиной кислоты 0,1%, нажмите кнопку ОК в обоих всплывающих окнах, чтобы сохранить метод. Запустите 60-минутный нелинейный LC-градиент с использованием воды и ацетонитрила, оба с 0,1% муравьиной кислотой.
Проверка элюирования образца из ВЭЖХ в TIMS ToF с помощью ионизации наноэлектрораспылением в режиме положительной ионизации. Чтобы идентифицировать пептидные последовательности и сайты модификации с помощью инструмента MS-Digest, сгенерируйте теоретический список пептидов с помощью Protein Prospector. Затем проведите теоретическое расщепление с учетом условий переваривания, типа посттрансляционных модификаций, диапазона размеров пептидов, диапазона обнаружения массы и потенциального количества пропущенных расщеплений.
Чтобы проанализировать полученные данные, выполните поиск масс в нескольких состояниях заряда, в диапазоне от плюс одного до плюс четырех, для каждого теоретического пептида. После определения отношения массы к заряду каждого выберите пик и подтвердите МСМС, используя теоретический список ионов фрагментации, основанный на пептидной последовательности. В том числе и посттрансляционные модификации.
Спектры фрагментации пептидов выявили три различных варианта пептидов с различными посттранскрипционными модификациями, включая пропионильные и ацетильные группы, в разных положениях. Стандарт пропионилированного гистона H3 показал более длинные пептиды, чем немодифицированная версия. Гистоны, извлеченные из клеток HeLa S3, показали множественные паттерны посттрансляционной модификации в одних и тех же аминокислотных позициях.