शुरू करने के लिए, euthanized विच्छेदित माउस की हड्डियों से ऊतक को हटा दें. साफ हड्डियों को बर्फ पर रखे एफएसीएस बफर युक्त एक नई छह-अच्छी प्लेट में रखें। FACS बफर के दो से पांच मिलीलीटर के साथ एक मोर्टार में हड्डियों को स्थानांतरित करें।
हड्डियों को गोलाकार गति में तब तक पीसें जब तक कि अस्थि मज्जा न निकल जाए। तीन मिलीलीटर सिरिंज के साथ, अस्थि मज्जा को समरूप बनाने के लिए ऊपर खींचें और फ्लश करें। होमोजेनेट को दूसरे सिरिंज में खींचें, फिर इसे 70 माइक्रोमीटर सेल स्ट्रेनर के माध्यम से 50 मिलीलीटर ट्यूब में फ़िल्टर करें।
दूसरी बार समरूप बनाने से पहले FACS बफर के साथ मोर्टार में उनके फिल्टर से ऊतक के टुकड़ों को कुल्ला। पहले की तरह धुले हुए ऊतक को छान लें। अगला, शेष हड्डी spicules FACS बफर के साथ मोर्टार में वापस कुल्ला.
फिर अधिकतम उपज सुनिश्चित करने के लिए टुकड़ों को 15 मिलीलीटर ट्यूब में फ्लश करें। अस्थि मज्जा को पचाने के लिए, पहले इसे चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 300 ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। पाचन मिश्रण के दो मिलीलीटर में अस्थि मज्जा गोली को फिर से निलंबित करें।
मिश्रण को 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। फिर इसे रोटेटर पर 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अब, एंजाइमी पाचन को रोकने के लिए FACS बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
मिश्रण को 70 माइक्रोमीटर सेल स्ट्रेनर के माध्यम से 50 मिलीलीटर ट्यूब में फ़िल्टर करें। चार डिग्री सेल्सियस पर सात मिनट के लिए 400 ग्राम पर निलंबन अपकेंद्रित्र। आरबीसी लाइसिस बफर के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।
इसके बाद, लाइसिस को रोकने के लिए FACS बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें। फिर मिश्रण को पहले की तरह 50 मिलीलीटर ट्यूब में छान लें। अंत में, चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 300 ग्राम पर मिश्रण अपकेंद्रित्र.
सतह पर तैरनेवाला त्यागने के बाद, FACS बफर के 100 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। हड्डी के स्पाइक्यूल्स के पाचन के लिए, सबसे पहले, हड्डी के स्पाइक्यूल्स को भंवर करें। सतह पर तैरनेवाला छानना और नीचे की हड्डियों को बनाए रखें।
इसके बाद, हड्डी के स्पिक्यूल पाचन मिश्रण के एक मिलीलीटर में स्पाइक्यूल्स को फिर से निलंबित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए एक रोटेटर पर ट्यूब सेते हैं. अंत में, FACS बफर के 10 मिलीलीटर के साथ पाचन बंद करो.
मिश्रण को 50 मिलीलीटर ट्यूब में फ़िल्टर करें जिसमें आरबीसी लाइस्ड और पचा हुआ अस्थि मज्जा होता है।