首先,在冷的PBS中冲洗L3阶段果蝇幼虫三次,每次五分钟。使用两对锋利的镊子,握住幼虫的前部并取出大约 2/3 的身体组织。用一对镊子握住前 1/3 的幼虫,用另一对镊子握住嘴钩。
然后缩回幼虫内部的嘴钩,直到幼虫完全倒置。移除腿椎间盘和大脑,以获得干净的倒置幼虫尸体,并将一对翼盘连接到气管上。将翼盘转移到一毫升离心管中。
将翼盘固定在4%多聚甲醛中,在室温下搅拌PBS稀释45分钟。固定后,用70%乙醇洗涤样品三次,每次五分钟。从麻醉的苍蝇上取下头部、腹部、腿部和翅膀,并将解剖的胸部放入冷的 PBS 中。
在4%多聚甲醛中,在1%Triton中稀释20分钟。然后在搅拌下使用PBT洗涤样品三次,每次五分钟。将胸部放在载玻片上的双面胶带上,并使用锋利的切片片将它们一分为二,以产生两个半斜体。
将半甲醇固定在4%多聚甲醛中45分钟,搅拌。在搅拌下使用PBT洗涤样品两次,每次20分钟。将偏躯置于冷的PBS中,并使用镊子小心地将间接飞行肌肉与半直立肌隔离开来。
在 70% 乙醇中在 4 摄氏度下透化肌肉 2 至 7 天。透化后,使用缓冲液A洗涤IFM两次,每次20分钟,然后加入400微升杂交缓冲液,并在37摄氏度的热混合器中预杂交肌肉30分钟。加入 100 μL 含有探针和一抗的新鲜制备的杂交缓冲液。
将样品在 37 摄氏度的黑暗中以 300 RPM 在热混合器中孵育 16 小时。孵育后,使用温热的缓冲液A洗涤样品三次,每次10分钟。然后将样品在二抗中孵育,并将DAPI在缓冲液A中以37摄氏度稀释一小时。
用缓冲液B洗涤样品三次,每次20分钟,然后将它们转移到显微镜载玻片上。擦去残留的缓冲液 B,并在载玻片上加入 30 微升封固剂。将 18 x 18 毫米的盖玻片放在载玻片上,并用指甲油密封盖玻片。