शुरू करने के लिए, ठंड पीबीएस में प्रत्येक पांच मिनट के लिए तीन बार एल 3 चरण ड्रोसोफिला लार्वा कुल्ला. तेज संदंश के दो जोड़े का प्रयोग, लार्वा के पूर्वकाल भाग पकड़ और शरीर के ऊतकों के लगभग 2/3 हटा दें. लार्वा के पहले 1/3 को संदंश की एक जोड़ी और दूसरी जोड़ी के साथ मुंह के हुक के साथ पकड़ो।
फिर लार्वा के अंदर मुंह के हुक को तब तक वापस लें जब तक कि लार्वा पूरी तरह से उल्टा न हो जाए। श्वासनली से जुड़ी विंग डिस्क की एक जोड़ी के साथ एक साफ उलटा लार्वा शव प्राप्त करने के लिए पैर डिस्क और मस्तिष्क निकालें। विंग डिस्क को एक-मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए पीबीएस में पतला 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में विंग डिस्क को ठीक करें। निर्धारण के बाद, 70% इथेनॉल के साथ प्रत्येक पांच मिनट के लिए नमूने तीन बार धो लें. संवेदनाहारी मक्खियों से सिर, पेट, पैर, और पंखों निकालें और ठंड पीबीएस में विच्छेदित thoraxes जगह.
आंदोलन के तहत 20 मिनट के लिए 1% ट्राइटन में पतला 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में वक्ष को उपसर्ग करें। फिर आंदोलन के तहत पीबीटी का उपयोग कर प्रत्येक पांच मिनट के लिए तीन बार नमूने धो लें. थोरैक्स को एक ग्लास स्लाइड पर दो तरफा टेप पर रखें, और दो हेमिथोरेस का उत्पादन करने के लिए एक तेज माइक्रोटोम ब्लेड का उपयोग करके उन्हें द्विभाजित करें।
आंदोलन के तहत 45 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में हेमिथोरेस को ठीक करें। आंदोलन के तहत पीबीटी का उपयोग कर प्रत्येक 20 मिनट के लिए नमूने दो बार धो लें. ठंड पीबीएस में hemithoraces प्लेस और ध्यान से hemithoraces से अप्रत्यक्ष उड़ान की मांसपेशियों को अलग करने के लिए संदंश का उपयोग करें.
चार डिग्री सेल्सियस पर दो से सात दिनों के लिए 70% इथेनॉल में मांसपेशियों को पारगम्य करें। पारगम्यता के बाद, IFMs को 20 मिनट के लिए दो बार बफर A का उपयोग करके धोएं, फिर संकरण बफर के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें और थर्मल मिक्सर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मांसपेशियों को पूर्व-संकरण करें। ताजा तैयार संकरण बफर के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें जिसमें जांच और प्राथमिक एंटीबॉडी शामिल हैं।
एक थर्मल मिक्सर में 300 RPM पर 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में नमूने सेते हैं. इनक्यूबेशन बाद, 10 मिनट प्रत्येक के लिए गर्म बफर ए का उपयोग करके नमूनों को तीन बार धो लें। फिर माध्यमिक एंटीबॉडी में नमूनों को इनक्यूबेट करें और एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बफर ए में पतला डीएपीआई करें।
उन्हें एक खुर्दबीन स्लाइड पर स्थानांतरित करने से पहले 20 मिनट के लिए बफर बी के साथ तीन बार नमूने धो लें. अवशिष्ट बफर बी को मिटा दें और स्लाइड पर बढ़ते माध्यम के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें। स्लाइड पर एक 18-बाय -18 मिलीमीटर कवर पर्ची रखें और नेल पॉलिश का उपयोग करके कवर पर्ची को सील कर दें।