시작하려면 L3 단계 초파리 유충을 차가운 PBS에서 각각 5분 동안 세 번 헹굽니다. 두 쌍의 날카로운 집게를 사용하여 유충의 앞부분을 잡고 신체 조직의 약 2/3를 제거합니다. 한 쌍의 집게로 유충의 처음 1/3을 잡고 다른 쌍으로 입 고리를 잡습니다.
그런 다음 유충이 완전히 뒤집힐 때까지 유충 내부의 입 고리를 집어넣습니다. 다리 디스크와 뇌를 제거하여 기관에 한 쌍의 날개 디스크가 부착된 깨끗한 거꾸로 된 유충 사체를 얻습니다. 날개 디스크를 1밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
PBS에 희석한 4% 파라포름알데히드에 날개 디스크를 교반 하에서 실온에서 45분 동안 고정합니다. 고정 후 샘플을 70% 에탄올로 각각 5분 동안 세 번 세척합니다. 마취된 파리의 머리, 복부, 다리 및 날개를 제거하고 절개된 흉부를 차가운 PBS에 넣습니다.
1% 트리톤에 희석한 4% 파라포름알데히드를 흉부에 20분 동안 교반합니다. 그런 다음 교반 하에서 PBT를 사용하여 샘플을 각각 5분 동안 세 번 세척합니다. 유리 슬라이드의 양면 테이프에 흉부를 놓고 날카로운 마이크로톰 칼날을 사용하여 이등분하여 두 개의 반구를 만듭니다.
헤미토레이스를 4% 파라포름알데히드에 넣고 45분 동안 교반합니다. 교반 상태에서 PBT를 사용하여 샘플을 각각 20분 동안 두 번 세척합니다. 반구를 차가운 PBS에 넣고 겸자를 사용하여 간접 비행 근육을 반구에서 조심스럽게 분리합니다.
섭씨 4도에서 2-7일 동안 70% 에탄올에 근육을 투과시킵니다. 투과화 후 완충액 A를 사용하여 IFM을 각각 20분 동안 두 번 세척한 다음 혼성화 완충액 400마이크로리터를 첨가하고 열 믹서에서 섭씨 37도에서 30분 동안 근육을 사전 혼성화합니다. 프로브와 1차 항체를 포함하는 100마이크로리터의 갓 준비된 혼성화 완충액을 추가합니다.
섭씨 37도의 어두운 곳에서 열 믹서에서 300RPM으로 16시간 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후 따뜻한 완충액 A를 사용하여 샘플을 각각 10분 동안 세 번 세척합니다. 그런 다음 2차 항체 및 DAPI에 샘플을 섭씨 37도에서 1시간 동안 완충액 A에 희석하여 배양합니다.
샘플을 현미경 슬라이드로 옮기기 전에 버퍼 B로 각각 20분 동안 세 번 세척합니다. 잔류 버퍼 B를 닦아내고 슬라이드에 30마이크로리터의 장착 매체를 추가합니다. 18 x 18mm 크기의 커버 슬립을 슬라이드에 놓고 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 밀봉합니다.