打开配备40x和63x油浸物镜的共聚焦显微镜后,将载玻片放在显微镜载物台上。要对翼盘相关肌肉祖细胞和间接飞行肌肉或 IFM 进行成像,请将 DAPI 设置为激发 405 纳米和发射 450 纳米。然后选择激发为 496 纳米、发射为 519 纳米的 Alexa Fluor 488,为激发为 647、发射为 670 纳米的 smFISH 探针选择 Quasar 670。
使用DAPI信号和UV灯定位样品。将捕获的图像另存为 TIFF 文件。要对成体肌肉干细胞进行成像,请设置DAPI和Alexa Fluor 488的激发和发射波长,如前所述。
然后为 smFISH 探针设置 Alexa Fluor 555 和 Quasar 670 的波长。找到样本并将捕获的图像另存为 TIFF。启动图像 J 并导航到插件菜单。
选择“宏”,然后选择“编辑”以打开宏源代码。要量化幼虫中的 Mef2 smFISH 斑点,将对数半径设置为 3,将对数质量设置为 20。然后用模糊的 2 分割 Mef2 阳性细胞核,细胞核尺度参数为 30,细胞核阈值为负 8,细胞核大小为 300。
通过执行 run 命令启动宏。宏将自动加载指定文件夹中的所有图像并按顺序量化它们。在肌纤维中,将对数半径设置为 2.5,将对数质量设置为 60,模糊设置为 2,将核刻度参数设置为 100,将核阈值设置为零,将核大小设置为 300。
通过执行 run 命令启动宏。宏将自动加载指定文件夹中的所有图像并按顺序量化它们。分析后,检查文件 FISH 结果和文件 nucle 结果中显示的结果。
Mef2 和 Zfh1 转录本在 AMP 群体中均等检测,并分别与 Mef2 和 Zfh1 蛋白共定位。AMP的较高放大倍数可区分转录位点病灶和分散在细胞质中的成熟mRNA。同样,在分化的成人 IFM 和相关干细胞中检查了 Mef2 和 Zfh1 mRNA 的转录位点和分布。
内部构建的图像 J 宏有效地检测和分割了 Mef2 斑点和肌肉核。成体IFM和AMP中每个细胞核的Mef2 mRNA的定量分析没有显著差异。Mef2斑点分布定量结果显示,92%的Mef2 mRNA存在于细胞质中,8%与肌核相关。