Après avoir allumé le microscope confocal équipé d’objectifs à immersion dans l’huile 40x et 63x, placez la lame sur la platine du microscope. Pour imager les progéniteurs musculaires associés au disque alaire et les muscles de vol indirect ou IFM, réglez DAPI avec une excitation de 405 et une émission de 450 nanomètres. Sélectionnez ensuite Alexa Fluor 488 avec une excitation de 496 et une émission de 519 nanomètres, et Quasar 670 pour les sondes smFISH avec une excitation de 647 et une émission de 670 nanomètres.
Localisez l’échantillon à l’aide d’un signal DAPI et d’une lampe UV. Enregistrez les images capturées sous forme de fichiers TIFF. Pour imager les cellules souches musculaires adultes, définissez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission pour DAPI et Alexa Fluor 488 comme démontré précédemment.
Réglez ensuite les longueurs d’onde pour Alexa Fluor 555 et Quasar 670 pour les sondes smFISH. Localisez l’échantillon et enregistrez les images capturées au format TIFF. Lancez l’image J et accédez au menu des plugins.
Sélectionnez Macros, puis Modifier pour ouvrir le code source des macros. Pour quantifier les taches Mef2 smFISH chez les larves, définissez le rayon logarithmique sur trois et la qualité logarithmique sur 20. Segmentez ensuite les noyaux positifs Mef2 avec un flou de deux, un paramètre d’échelle de noyau de 30, un seuil de noyau de moins huit et une taille de noyau de 300.
Lancez la macro en exécutant la commande run. La macro chargera automatiquement toutes les images du dossier désigné et les quantifiera séquentiellement. Dans les fibres musculaires, définissez le rayon logarithmique sur 2,5, la qualité logarithmique sur 60, le flou sur deux, le paramètre d’échelle du noyau sur 100, le seuil du noyau sur zéro et la taille du noyau sur 300.
Lancez la macro en exécutant la commande run. La macro chargera automatiquement toutes les images du dossier désigné et les quantifiera séquentiellement. Après l’analyse, vérifiez les résultats affichés dans le fichier des résultats FISH et le fichier des résultats des noyaux.
Les transcrits Mef2 et Zfh1 ont été uniformément détectés dans la population AMP et colocalisés avec les protéines Mef2 et Zfh1 respectivement. Un grossissement plus élevé des AMP permet de distinguer les sites de transcription, les foyers et les ARNm matures dispersés dans le cytoplasme. De même, le site de transcription et la distribution des ARNm Mef2 et Zfh1 ont été examinés dans des IFM adultes différenciés et des cellules souches associées.
La macro J d’image, construite en interne, a détecté et segmenté efficacement les taches Mef2 et les noyaux musculaires. L’analyse quantitative de l’ARNm Mef2 par noyaux dans les IFM adultes et les AMP n’était pas significativement différente. La quantification de la distribution des taches Mef2 a montré que 92 % de l’ARNm Mef2 est présent dans le cytoplasme et que 8 % sont associés aux noyaux musculaires.
