40x और 63x तेल विसर्जन उद्देश्यों से लैस confocal माइक्रोस्कोप पर चालू करने के बाद, खुर्दबीन मंच पर स्लाइड जगह. विंग डिस्क से जुड़े मांसपेशी पूर्वजों और अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों या आईएफएम की छवि के लिए, डीएपीआई को 405 की उत्तेजना और 450 नैनोमीटर के उत्सर्जन के साथ सेट करें। फिर 488 नैनोमीटर की उत्तेजना और 519 नैनोमीटर के उत्सर्जन के साथ एलेक्सा फ्लोर 488 का चयन करें, और 647 नैनोमीटर की उत्तेजना और 670 नैनोमीटर के उत्सर्जन के साथ smFISH जांच के लिए क्वासर 670 का चयन करें।
DAPI सिग्नल और UV लैंप का उपयोग करके नमूने का पता लगाएँ। कैप्चर की गई छवियों को TIFF फ़ाइलों के रूप में सहेजें। वयस्क मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं की छवि के लिए, पहले दिखाए गए अनुसार DAPI और Alexa Fluor 488 के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य सेट करें।
फिर smFISH जांच के लिए Alexa Fluor 555 और Quasar 670 के लिए तरंग दैर्ध्य सेट करें। नमूने का पता लगाएँ और कैप्चर की गई छवियों को TIFF के रूप में सहेजें। छवि J लॉन्च करें और प्लगइन्स मेनू पर नेविगेट करें।
मैक्रोज़ का चयन करें, फिर मैक्रोज़ स्रोत कोड खोलने के लिए संपादित करें। लार्वा में Mef2 smFISH स्पॉट की मात्रा निर्धारित करने के लिए, लॉग त्रिज्या को तीन और लॉग गुणवत्ता को 20 पर सेट करें। फिर दो के धुंधलेपन के साथ Mef2 सकारात्मक नाभिक, 30 का एक नाभिक स्केल पैरामीटर, माइनस आठ का नाभिक दहलीज, और 300 का नाभिक आकार।
रन कमांड निष्पादित करके मैक्रो प्रारंभ करें। मैक्रो स्वचालित रूप से निर्दिष्ट फ़ोल्डर से सभी छवियों को लोड करेगा और उन्हें क्रमिक रूप से निर्धारित करेगा। मांसपेशी फाइबर में, लॉग त्रिज्या को 2.5, लॉग गुणवत्ता को 60, दो को धुंधला, नाभिक स्केल पैरामीटर को 100, नाभिक थ्रेसहोल्ड को शून्य और नाभिक आकार को 300 पर सेट करें।
रन कमांड निष्पादित करके मैक्रो प्रारंभ करें। मैक्रो स्वचालित रूप से निर्दिष्ट फ़ोल्डर से सभी छवियों को लोड करेगा और उन्हें क्रमिक रूप से निर्धारित करेगा। विश्लेषण के बाद, फ़ाइल मछली परिणामों और फ़ाइल नाभिक परिणामों में प्रदर्शित परिणामों की जाँच करें।
Mef2 और Zfh1 प्रतिलेखों को AMP आबादी में समान रूप से पाया गया और क्रमशः Mef2 और Zfh1 प्रोटीन के साथ सहस्थानीयकृत किया गया। साइटोप्लाज्म में बिखरे हुए प्रतिलेखन साइटों foci और परिपक्व mRNA के बीच प्रतिष्ठित AMPs का एक उच्च आवर्धन। इसी तरह, प्रतिलेखन साइट और Mef2 और Zfh1 mRNA के वितरण की जांच विभेदित वयस्क IFMs और संबंधित स्टेम कोशिकाओं में की गई थी।
इन-हाउस निर्मित छवि जे मैक्रो ने प्रभावी रूप से Mef2 स्पॉट और मांसपेशी नाभिक का पता लगाया और खंडित किया। वयस्क IFMs और AMPs में प्रति नाभिक Mef2 mRNA का मात्रात्मक विश्लेषण काफी भिन्न नहीं था। Mef2 स्पॉट वितरण की मात्रा का ठहराव से पता चला है कि Mef2 mRNA का 92% साइटोप्लाज्म में मौजूद है, और 8% मांसपेशियों के नाभिक से जुड़े हैं।