Etter å ha slått på konfokalmikroskopet utstyrt med 40x og 63x oljenedsenkingsmål, plasser lysbildet på mikroskoptrinnet. For å avbilde vingeskiven assosierte muskelprogenitorer og indirekte flyvemuskler eller IFM, sett DAPI med en eksitasjon på 405 og utslipp på 450 nanometer. Velg deretter Alexa Fluor 488 med en eksitasjon på 496 og utslipp på 519 nanometer, og Quasar 670 for smFISH-sondene med en eksitasjon på 647 og utslipp på 670 nanometer.
Finn prøven ved hjelp av et DAPI-signal og UV-lampe. Lagre bildene som er tatt, som TIFF-filer. For å avbilde de voksne muskelstamcellene, still inn eksitasjons- og utslippsbølgelengdene for DAPI og Alexa Fluor 488 som vist tidligere.
Sett deretter bølgelengdene for Alexa Fluor 555 og Quasar 670 for smFISH-sondene. Finn prøven og lagre bildene som er tatt, som TIFF. Start bilde J og naviger til plugins-menyen.
Velg Makroer og deretter Rediger for å åpne kildekoden for makroene. For å kvantifisere Mef2 smFISH-flekker hos larver, sett loggradiusen til tre og loggkvaliteten til 20. Deretter segmenterer du Mef2 positive kjerner med en uskarphet på to, en kjerneskalaparameter på 30, kjerneterskel på minus åtte og kjernestørrelse på 300.
Start makroen ved å utføre kjør-kommandoen. Makroen laster automatisk alle bilder fra den angitte mappen og kvantifiserer dem sekvensielt. I muskelfibre setter du loggradiusen til 2,5, loggkvaliteten til 60, uskarphet til to, kjerneskalaparameter til 100, kjerneterskel til null og kjernestørrelse til 300.
Start makroen ved å utføre kjør-kommandoen. Makroen laster automatisk alle bilder fra den angitte mappen og kvantifiserer dem sekvensielt. Etter analyse, sjekk resultatene som vises i fil FISH-resultater og filkjerner.
Mef2- og Zfh1-transkripsjonene ble jevnt detektert i AMP-populasjonen og kolokalisert med henholdsvis Mef2- og Zfh1-proteiner. En høyere forstørrelse av AMPs skilte mellom transkripsjonssteder foci og modent mRNA spredt i cytoplasma. På samme måte ble transkripsjonsstedet og distribusjonen av Mef2 og Zfh1 mRNA undersøkt i differensierte voksne IFM og tilhørende stamceller.
Den egenbygde J-makroen oppdaget og segmenterte effektivt Mef2-flekker og muskelkjerner. Den kvantitative analysen av Mef2 mRNA per kjerner i voksne IFM og AMPene var ikke signifikant forskjellige. Kvantifiseringen av Mef2-punktfordeling viste at 92% av Mef2 mRNA er tilstede i cytoplasma, og 8% er assosiert med muskelkjerner.
