Препарат лентивируса и трансдукция лентивируса для клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы

1 2 Для начала посмотрите на клетки HEK 293T3 за 24 часа до трансфекции 4 в 15-сантиметровой чашке, содержащей GMEN. 5 Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия 6 и 5% углекислого газа 7 до тех пор, пока они не достигнут конфлюенции от 40 до 50%. 8 Пометьте три пластиковые пробирки объемом 15 миллилитров 9 соответствующим названием лентивируса.

10 Добавьте в каждую пробирку 1,710 миллилитров восстановленной сыворотки 11 и 90 микролитров реагента для трансфекции. 12 Перемешайте содержимое путем вортекса 13 перед инкубацией пробирок при комнатной температуре. 14 Через пять минут добавьте упаковочную векторную смесь 15 в трансфекционную среду и вортекс.

16 Затем добавьте 7,5 микрограммов перепрограммирующего вектора 17 и регулятора 18 pWPT-GFP к соответствующей смеси для трансфекции. 19 Ввергните трубки в течение двух секунд 20 перед инкубацией в течение 15 минут при комнатной температуре. 21 Чтобы трансфицировать клетки 293T с каждым лентивирусом, 22 по каплям, добавьте в чашку смесь трансфективной ДНК.

23 Инкубируйте трансфицированные клетки при температуре 37 градусов Цельсия 24 и 5% углекислого газа. 25 Через 14-16 часов 26 замените среду на 30 миллилитров 27 свежей среды 293Т и продолжайте инкубацию в течение 60-72 часов. 29 Ежедневно наблюдайте за клетками 30 и проверяйте эффективность трансфекции.

31 Затем перенесите культуру 32 для трансфекции вируса в 15-миллилитровые пробирки 33 и поверните вниз при 1932 G в течение 10 минут 34 при четырех градусах Цельсия. 35 Отфильтруйте лентивирусную надосадочную жидкость 36 с помощью шприцевого фильтра 37 0,45 микрона в новую 50-миллилитровую пробирку. 38 За день до трансдукции лентивируса 39 готовят две лунки из 6-луночного планшета 40, содержащего 100 000 клеток PDAC на лунку.

41 Приготовьте две пробирки по 15 миллилитров 42 с двумя миллилитрами предварительно подогретой среды PDAC. 43 В первую пробирку 44 добавляем 12 миллилитров перепрограммируемого лентивируса. 45 Затем добавьте 12 микролитров полибрена 46 и перемешайте с помощью пипетирования.

47 Ко второму тюбику 48 добавляем два микролитра полибрена. 49 Теперь осторожно удалите среду из каждой лунки 50 из 6-луночной пластины 51 и промойте один раз PBS при комнатной температуре. 52 Добавьте среду для перепрограммирования инфекции 53 из первой пробирки в первую лунку.

54 Добавьте смесь из второй трубки во вторую лунку. 55 Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия 56 с 5% углекислого газа и 5% кислорода. 57 На следующий день замените среду 58 из обеих лунок на свежую среду 59 PDAC и продолжайте инкубацию 60 в течение 48 часов, как показано на рисунке.