首先,使用 25 微升汉密尔顿注射器腹膜内注射 15 微升 Addgene 麻醉的大鼠幼崽。接下来,剃掉麻醉的六到八周大幼崽的毛发和胡须。将大鼠安装在带有耳杆的立体定位框架上。
并在下面放置加热垫以保持动物的体温。接下来,将纱布浸入冰冷的盐水中,以尽量减少出血。用 15 号手术刀在颅骨上方的皮肤和肌肉中线切开一个切口。
拉开皮肤和肌肉,露出头骨。用一乘四的圆形钻头,小心地在颅盖上穿孔,露出前脑。然后用龙格斯切开头骨。
用 15 号手术刀在大脑和嗅球上切开一个切口。用刮刀小心地将硬脑膜与颅骨断开。然后轻轻抬起被切断的大脑,以显示三叉神经节和颅底。
用烧灼笔烧灼出血。要对 GCaMP6-X 进行成像,请将颅骨腔放在显微镜物镜下方。然后将终末节聚焦。
接下来,对面部的一平方厘米施加机械刺激。使用 20 倍物镜可视化对刺激有反应的三叉神经节神经元。要使用采集软件随时间收集荧光信号,请按采集菜单下方的流采集按钮。
然后将帧数设置为 300,将采集时间设置为 90 秒。设置相机参数以帧速率采集图像。在三分钟内获得稳定的基线记录。
较大的病毒滴度导致大鼠幼崽的神经元感染增加。轻机械刺激仅激活三叉神经节的V2区域。大多数神经元的静息荧光相对较低,几乎没有自发增加。
自然刺激,特别是点点刺激,引发了最强大的神经元反应。慢性收缩损伤模型中的刷子刺激使损伤者相对于对侧的峰值反应幅度增加了两倍。当连续施加两个刺激时,对第二个刺激的反应有显着的放大。