للبدء ، قم بزرع خلايا DAKIKI في صفيحة من ستة آبار بكثافة ستة ملايين خلية لكل بئر. قم بإعداد المجموعات التجريبية المختلفة ، وبعد المعالجة المقابلة ، بناء على طريقة التجميع ، احتضان الألواح لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استخرج إجمالي الحمض النووي الريبي من خلايا DAKIKI ، باتباع التعليمات الواردة في مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي الإجمالية.
خذ ميكرولتر واحد من الحمض النووي الريبي المستخرج من كل مجموعة من العينات لقياس تركيزه. قم بنسخ ميكروجرام واحد من إجمالي الحمض النووي الريبي من كل عينة إلى حمض نووي تكميلي ، باتباع تعليمات المجموعة. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي ، أو تضخيم RT-PCR للكشف عن تعبير كل جين.
للنشاف الغربي بعد الحضانة الأولية لمدة 24 ساعة ، اجمع الخلايا من كل مجموعة. أضف حجما مناسبا من محلول تحلل الخلايا إلى الخلايا المجمعة قبل حضنها على الجليد لمدة 30 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي العينات في 13 ، 500g لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، وجمع طاف لمزيد من التحليل.
دوامة عينات البروتين مع 5X SDS-PAGE Loading Buffer بنسبة أربعة إلى واحد وتسخين العينات المختلطة عند 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لتشويه البروتين قبل الرحلان الكهربائي. بمجرد اكتمال الجري ، انقل الجل إلى أغشية PVDF. لمنع الغشاء ، احتضانه في 5 ٪ حليب خالي الدسم لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، احتضان الغشاء بالأجسام المضادة الأولية المقابلة لمدة 24 ساعة أثناء استخدام الجسم المضاد بيتا أكتين كعنصر تحكم داخلي. بعد ذلك ، احتضان الأغشية مع الجسم المضاد IgG المضاد للأرانب الماعز الثانوي المقابل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. أخيرا ، عالج الأغشية بكمية مناسبة من محلول عمل التلألؤ الكيميائي المحسن لاكتشاف شريط البروتين.
أظهرت النتائج الكمية RT-PCR أن تعبير mRNA النسبي ل C1GalT1 و Cosmc قد انخفض تنظيمه في خلايا DAKIKI في مجموعة النموذج ، مقارنة بالمجموعة الضابطة. قام ديوسين بتنظيم mRNA النسبي لكلتا الدرجتين المختلفتين مقارنة بمجموعة النموذج. أظهرت نتائج النشاف الغربي أيضا أنه بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، انخفض التعبير البروتيني ل C1GalT1 و Cosmc في خلايا DAKIKI في المجموعة النموذجية.
تم تنظيم تعبيرات البروتين بعد تدخل الديوسين.
