Başlamak için, DAKIKI hücrelerini kuyu başına altı milyon hücre yoğunluğunda altı oyuklu bir plakada tohumlayın. Farklı deney gruplarını kurun ve ilgili tedaviden sonra, gruplama yöntemine dayanarak, plakaları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 saat inkübe edin. Toplam RNA ekstraksiyon kitindeki talimatları izleyerek DAKIKI hücrelerinden toplam RNA'yı çıkarın.
Konsantrasyonunu ölçmek için her numune grubundan ekstrakte edilen RNA'dan bir mikrolitre alın. Kit talimatlarını izleyerek her numuneden bir mikrogram toplam RNA'yı tamamlayıcı DNA'ya ters kopya edin. Her genin ekspresyonunu tespit etmek için ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu veya RT-PCR amplifikasyonu gerçekleştirin.
İlk 24 saatlik inkübasyondan sonra batı lekeleme için, her gruptan hücreleri toplayın. Toplanan hücrelere 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe etmeden önce uygun hacimde hücre lizis çözeltisi ekleyin. Numuneleri 13.500 g'da dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve daha fazla analiz için süpernatanı toplayın.
Protein örneklerini 5X SDS-PAGE Yükleme Tamponu ile dörde bir oranında vorteksleyin ve elektroforezden önce proteini denatüre etmek için karışık örnekleri 100 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Çalışma tamamlandığında, jeli PVDF membranlarının üzerine aktarın. Membranı bloke etmek için, oda sıcaklığında% 5 yağsız sütte iki saat inkübe edin.
Daha sonra, iç kontrol olarak beta-aktin antikoru kullanılırken zarı karşılık gelen birincil antikorlarla 24 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, zarları karşılık gelen ikincil keçi anti-tavşan IgG antikoru ile oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Son olarak, membranları protein bandı tespiti için uygun miktarda gelişmiş kemolüminesans çalışma solüsyonu ile tedavi edin.
Kantitatif RT-PCR sonuçları, C1GalT1 ve Ccosmc'nin nispi mRNA ekspresyonunun, kontrol grubuna kıyasla model grubundaki DAKIKI hücrelerinde aşağı regüle edildiğini gösterdi. Dioscin, model grubuna kıyasla her iki farklı derecenin bağıl mRNA'sını yukarı regüle etti. Western blotlama sonuçları ayrıca kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, model grubundaki DAKIKI hücrelerinde C1GalT1 ve Cosmc protein ekspresyonunun azaldığını göstermiştir.
Diosin müdahalesinden sonra protein ekspresyonu yukarı regüle edildi.
