Name: Disseksjon av tredje stjerne Drosophila larve for hjernemetabolittavbildning
Uploaded: 2023-10-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Third Instar Drosophila Larva for Brain Metabolite Imaging at JoVE.com

dissection of third instar drosophila larva for brain metabolite imaging

Overvåking av hjernemetabolitttransport i Drosophila ved hjelp av FRET-sensorer

The brain has high energy requirements due to the high cost of restoring ion gradients in neurons caused by neuronal electric signal generation and transmission, as well as synaptic transmission1,2. This high energy demand has long been thought to be met by the continuous oxidation of glucose to produce ATP3. Specific transporters at the blood-brain barrier transfer the glucose in the blood to the brain. Constant glycemic levels ensure that the brain receives a steady supply of glucose4. Interestingly, growing experimental evidence suggests that molecules derived from glucose metabolism, such as lactate and pyruvate, play an important role in the brain cells&#39; energy production5,6. However, there is still some debate about how important these molecules are for energy production and which cells in the brain produce or use them7,8. The lack of appropriate molecular tools with the high temporal and spatial resolution required for this task is a significant issue that has prevented this controversy from being completely resolved.
The development and application of several engineered fluorescent metabolic sensors have resulted in a remarkable increase in our understanding of where and how metabolites are produced and used, as well as how the metabolic fluxes occur during basal and high neuronal activity9. Genetically encoded metabolic sensors based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy, such as ATeam (ATP), FLII12Pglu700&#181;&#948;6 (glucose), Laconic (lactate), and Pyronic (pyruvate), have contributed to our understanding of brain energy metabolism10,11,12,13. However, due to the high costs and sophisticated equipment required to conduct experiments on live animals or tissues, results in vertebrate models are still primarily limited to cell cultures (glial cells and neurons).
The emerging use of the Drosophila model to express these sensors has revealed that key metabolic features are conserved across species and their function can be easily addressed with this tool. More importantly, the Drosophila model has shed light on how glucose and lactate/pyruvate are transported and metabolized in the fly brain, the link between monocarboxylate consumption and memory formation, and the remarkable demonstration of how increases in neural activity and metabolic flux overlap14,15,16,17. The method presented here for measuring monocarboxylate, glucose, and ATP levels using genetically encoded FRET sensors expressed in the larval brain allows researchers to learn more about how the brain of Drosophila uses energy, which can be applied to the brains of other animals.
We show that this method is effective for detecting lactate and glucose in glial cells and neurons, and that a monocarboxylate transporter (Chaski) is involved in lactate import into glial cells. We also demonstrate a simple method for studying metabolite changes during increased neuronal activity, which can be easily induced by bath application of a GABAA receptor antagonist. Finally, we show that this methodology can be used to measure monocarboxylate and glucose transport in other metabolically significant tissues, such as fat bodies.

Forfatter Spotlight: Fremskritt innen forskning på hjernens energimetabolisme ved hjelp av Drosophila-modellen

Visualisering av monokarboksylater og andre relevante metabolitter i Ex Vivo Drosophila larvehjernen ved hjelp av genetisk kodede sensorer

The brain is a tissue with a high energy consumption that mostly uses glucose as fuel. On the other hand, experimental data suggests that other metabolites like ketone bodies and monocarboxylates might be useful as energy sources. However, there is a still debate on which brain cells are the producers and primary consumers.Lactate has been demonstrated to be a relevant metabolite in vertebrates to drive brain activity in vivo. Our group and others have shown in Drosophila the importance of monocarboxylate molecules to fuel the high energy requirements in neurons, as well as the need of glial-derived lactate and ketone bodies in memory formation. We have described monocarboxylate transporters in the Drosophila brain and determined that the transfer of lactate from glial cells to neurons is necessary to maintain the neural activity during high-demand periods.The main advantage is to have the possibility to determine the intracellular dynamic of glucose and its metabolites, such as lactate, pyruvate, and ATB in glial cells and neurons during basal and high neural activity. Additionally, to measure the transfer of these molecules in other living tissues, such as the fat bodies. The use of the Drosophila as in vivo model for the study of brain energy metabolism using a simple setup.This will allow the modeling of metabolic diseases or to better understand the energy management in the normal brain or during the development of neurodegenerative diseases.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Third Instar Drosophila Larva for Brain Metabolite Imaging at JoVE.com

Disseksjon av tredje stjerne Drosophila larve for hjernemetabolittavbildning

For å begynne, plasser 25 millimeter glassdeksel glir inn i brønnene til en seks-brønns cellekulturplate. Plasser en dråpe polylysin i midten av hvert deksel. Etter at inkuberingen er fullført, vask hver dekselslip tre ganger med destillert vann.Vask deretter dekselet to ganger med en kalsiumfri saltoppløsning. Deretter installerer du dekslene i et opptakskammer og fyller det med kalsiumfritt saltvann. Samle de vandrende tredje instar larver fra ønsket genetisk kryss av drosophila.Overfør larvene til en tallerkenbrønn, vask deretter larvene tre ganger med destillert vann. Legg larvene i en annen glassdisseksjonsfat som inneholder 750 mikroliter iskald, kalsiumfri saltoppløsning. Legg nå en larve under et stereomikroskop.Med et par tang, gjør en tverrgående kutt over baksiden av magen. Skyv kjeven med tangen for å snu larvene innvendig ut. Vær oppmerksom på den ventrale nervestrengen ved siden av kjeven.Fjern forsiktig de imaginære platene og gjenværende hjernevev. Deretter skiller du den ventrale nerveledningen med den sentrale hjernen og optiske lober fra resten av vevet. Overfør den ventrale nervestrengen til opptakskammeret som inneholder kalsiumfri saltoppløsning.For å unngå forstyrrelser, fest de resterende nervene til bunnen av dekselet med tang. For å utføre eksperimenter på fettlegemer, fortsett å isolere fettvevet fra den utslåtte larven. Plasser de isolerte fettlegemene som uttrykker båndsensorene i opptakskammeret.For å skaffe bilder av vev som uttrykker sensorer, slå på belysningssystemet til mikroskopet. Plasser opptakskammeret som inneholder ventrale nerveledninger eller fettlegemer på scenen i et fluorescerende mikroskop. For å se GCaMP6f-fluorescens, sett eksitasjonsbølgelengden til 488 nanometer.For metabolitter som lakoniske, pyroniske, ATP eller glukosesensorer, sett eksitasjonen til 440 nanometer. Sett nå bildeopptaket med jevne mellomrom for GCaMP6f og metabolittsensor. Plasser målet for nedsenking av vann, slik at det forblir nedsenket.Deretter kobler du opptakskammeret til et perfusjonssystem. Bruk en lav-flux peristaltisk pumpe for å trekke ut væsken fra kammeret og opprettholde en konstant strøm på tre milliliter per minutt. Plasser løsningen som inneholder rør 25 centimeter over mikroskoptrinnet.Før stimulering, oppnå en stabil fluorescensbaseline ved å la opptaksløsningen strømme i fem til 10 minutter. Erstatt nå strømningsløsningen med stimuleringsløsningen som inneholder glukose, pyruvat eller laktat i fem minutter. Ta bildene av den stimulerte ventrale nervestrengen som ble utsatt for 80 mikromolært picrotoxin for å vurdere nevronaktivitet.Lakoniske sensorer i både gliaceller og motorneuroner reagerer på ett millimolært laktat med tilsvarende hastighet ved starten av pulsen. Imidlertid når motorneuronene en høyere økning over grunnlinjen i løpet av fem minutters puls. Glukosesensorens signal økte med tilsvarende hastighet i gliacellene og nevronene når de ble utsatt for fem millimolar glukose.Under glukosepulsen øker imidlertid signalet i nevroner mer enn i gliaceller. Å slå ut Chaski-transportøren reduserte laktattransporten i gliaceller. Pikrotoksininduserte økninger i nevronaktivitet resulterte i et forbigående fall i ATP-nivåer i soma av motorneuroner.Lakonisk sensor ble observert å være godt uttrykt i fettlegemer. Økt fluorescens av glukosesensorene ble sett når fettlegemene ble utsatt for økende glukosekonsentrasjon. Økte laktat- og pyruvatkonsentrasjoner resulterte i en proporsjonal økning i lakonisk og pyronisk fluorescens.