Para comenzar, prepare muestras claras de tejido renal. A continuación, encienda el microscopio confocal activando primero la potencia del láser y luego activando el interruptor de control confocal. A continuación, encienda la computadora, encienda el microscopio e inicie el hardware confocal.
Después de ejecutar la autocomprobación, inicie el software confocal. Seleccione la lente adecuada. Recupere la muestra del reactivo R cúbico y colóquela en la placa confocal.
Cúbralo para evitar que el reactivo R cúbico se seque. Mueva la muestra al centro del campo de visión y ajuste el enfoque hasta que la muestra esté enfocada. Para la reconstrucción 3D, ajuste el plano de zoom en una dirección hasta que no se vea fluorescencia, definiendo esta posición como la parte superior.
A continuación, ajuste el plano de zoom en la dirección opuesta hasta que no se vea fluorescencia, definiendo esta posición como la parte inferior. Haga clic en el botón Ejecutar en la esquina inferior derecha del cuadro de diálogo para iniciar el escaneo. Para la reconstrucción de imágenes grandes, coloque el campo de visión en el centro de la muestra y establézcalo como centro.
Elija un campo de visión de dos por dos. En la interfaz multifunción ND, seleccione la pila Z para reconstruir imágenes grandes. Ajuste las distintas opciones del panel según sea necesario y pulse el botón de ejecución para comenzar el escaneo.
Adhiera el riñón transparente al adaptador de fijación de muestras con pegamento y espere hasta que el riñón esté bien sujeto. A continuación, sumerja el riñón en el recipiente de muestras y deslice el recipiente de muestras en el sistema de microscopio. Sella la escotilla.
En la interfaz de localización, ajuste la muestra a una posición de observación adecuada. Cambie a la interfaz de adquisición, establezca la ruta óptica. Seleccione el láser de 488 nanómetros.
Elija el filtro de haz de luz de 405-488-561-640 y, a continuación, ajuste el bloque de filtro de división óptica a SBS LP 490. Seleccione la cámara dos y modifique el pseudocolor a verde. Introduzca el desplazamiento Z izquierdo y derecho obtenido en el submenú del canal.
Seleccione el zoom más pequeño y ajústelo para obtener claridad óptica. Identifique el límite XY y el rango Z para todo el órgano. A continuación, module la intensidad del láser y el tiempo de exposición a menos de 10 milisegundos.
Inicie el proceso haciendo clic en iniciar experimento. Si el tejido es excesivamente grande, combine dos o más imágenes con la unión de imágenes utilizando el software de microscopía. Abra el archivo capturado y seleccione procesamiento.
A continuación, el método y la costura, seguidos del parámetro de método. Haga clic en aplicar para finalizar la unión de la imagen. Se utilizó la hebra fitindex inyectada intravascularmente para marcar los glomérulos.
En el riñón aclarado, los glomérulos se podían observar claramente mediante el uso de microscopía de lámina de luz o microscopía confocal.