Name: Routine Passaging of Patient-Derived Gastric Organoids Through Fragmentation
Uploaded: 2024-01-26T14:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Routine Passaging of Patient-Derived Gastric Organoids Through Fragmentation at JoVE.com

routine passaging of patient-derived gastric organoids through fragmentation

יצירת אורגנואידי קיבה אנושיים מביופסיות אנדוסקופיה עליונה

Organoids are miniature three-dimensional (3D) cellular structures that resemble the architecture and functionality of the organs from which they were derived1,2. These lab-grown models are created by cultivating stem cells or tissue-specific cells in a controlled environment that allows these cells to self-organize and differentiate into various cell types1,2,3. One of the key advantages of organoids is their ability to recapitulate human biology more closely than traditional two-dimensional (2D) cell cultures1,2,3. In particular, human organoids have been shown to maintain the genetic diversity of their tissue of origin3,4,5. Organoids offer a unique opportunity to study human organ development, model diseases, and test potential therapeutics in a controlled laboratory setting. Furthermore, organoids can be derived from individual patient samples, enabling personalized medicine approaches and the potential development of individualized treatments3,6,7.
Researchers have used human gastric organoids to investigate various aspects of gastric biology and pathology. Prominent examples include the use of patient-derived organoids (PDOs) to predict gastric cancer chemotherapy responses8,9,10 and model the epithelial response to Helicobacter pylori infection11,12,13. Human gastric organoids consist of various cell types found in the stomach, including neck cells, pit cells, and other supporting cells11,14. Gastric organoids can either be generated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) or stem cells directly isolated from gastric tissue obtained via biopsies or from gastric resection specimens11,14. The isolation of gastric stem cells from gastric tissue is commonly done by isolating and culturing gastric glands or enzymatically digesting tissue samples to liberate single cells9,13,15. Importantly, the differentiation of cells within gastric organoids generated using either of these techniques has been shown to be similar13. The protocol described herein focuses on a single-cell digest.
Organoids represent a scientific innovation that bridges the gap between traditional cell culture and whole organs. As research in the field continues to progress, organoids are poised to contribute to the development of more effective treatments and therapies for a wide range of applications. Given the rising utilization of gastric PDOs, there is a timely need for a standardized approach to their generation. Here, the protocol for generating human gastric PDOs from single cells isolated from benign gastric biopsy tissue acquired during upper endoscopy is described. Importantly and uniquely, a standardized number of single cells is determined for seeding to reliably generate gastric PDOs and allow subsequent characterization. Using this technique, reliable differences in the formation and growth of organoids generated from biopsies of either the gastric body or gastric antrum are demonstrated.

מחבר זרקור: יצירה והשוואה בין אורגנואידים קיבה שמקורם במטופל מאזורים שונים של הקיבה 

הקמה ואפיון של אורגנואידי קיבה שמקורם במטופל מביופסיות של גוף קיבה שפיר ואפיתל אנטראלי

Our research focuses on hereditary causes of gastric cancer. In particular, we're interested in hereditary diffuse gastric cancer due to disease-causing variants in either the CDH1 or CTNNA1 gene. We also investigate the role of BRCA1 and BRCA2 in gastric cancer risk and carcinogenesis.Organoids are increasingly being utilized in a variety of research domains and gastroenterology is no exception, so with this comes a need for standardization of these techniques to generate these organoids, in particular patient-derived gastric organoids. Our protocol offers a step-by-step method to reliably generate patient-derived gastric organoids from biopsies of both the antral and body regions of the stomach. In particular, we utilize a single-cell digest approach to allow for standardized seeding of cells in an effort to make reliable comparisons amongst organoids generated from different patients.Our findings show that compared to patient-derived gastric organoids from the body region of the stomach, those from the antral region actually grow more numerous and larger in size over the course of 20 days post initial seeding. These findings should be taken into account by researchers looking to utilize gastric organoids derived from different regions of the stomach.

Watch this Scientific Journal Video about Routine Passaging of Patient-Derived Gastric Organoids Through Fragmentation at JoVE.com

Routine Passaging of Patient-Derived Gastric Organoids Through Fragmentation  

העברה שגרתית של אורגנואידי קיבה שמקורם במטופל באמצעות פיצול

לאחר שהאורגנואידים שמקורם בקיבה מוכנים לאריזה, יש להתחיל במעבר שגרתי של האורגנואידים. ראשית, הסר את המדיה מכל באר, המכילה את האורגנואידים, המוטבעים במטריצת קרום המרתף, שנעשתה בצלחת 24 בארות. לאחר מכן יש לפזר מיליליטר אחד של מדיית DMEM F12 מתקדמת קרה כקרח, ישירות על כיפת מטריצת קרום מרתף.ממשיכים לשאוף ולפזר את המדיה, עד שכל שברי הכיפה מתנתקים מהצלחת. לאחר מכן להעביר הן את המדיה והן את מטריצת קרום המרתף המקוטעת מהבאר לבאר הבאה ולחזור על התהליך עבור כל הבארות המיועדות לאריזה. לאחר פירוק כיפת מטריצת קרום המרתף האחרונה, מוציאים את המדיה ואת התערובת לצינור 1.5 מיליליטר.חבר קצה של 1000 מיקרוליטר לפיפטה P1000 ולאחר מכן הכנס קצה זה לקצה של 200 מיקרוליטר. באמצעות מערך פיפטה זה פיפטה נמרצת פיפטה תערובת מטריצת אורגנואידים למעלה ולמטה, בערך 25 פעמים כדי לפרק את האורגנואידים לחתיכות קטנות. צנטריפוגה את תערובת האורגנואידים המקוטעת, באמצעות צנטריפוגה שולחנית בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ב 2000 גרם.באמצעות פיפטה שואפים את המדיה ואת מטריצת קרום המרתף supernatant.הוסף את הנפח המחושב של מטריצת קרום מרתף טרי לאורגנואידים הכדוריים בצינור. מזלפים בעדינות את תכולת הצינור למעלה ולמטה כדי לערבב. במהירות aliquot, 50 מיקרוליטר של תערובת מטריצת אורגנואיד לתוך בארות בודדות של צלחת 24 בארות.מכסים את הצלחת מיד ובתנועה חלקה אחת, הופכים את הצלחת. הניחו את הצלחת ההפוכה באינקובטור תרבית רקמה של 37 מעלות צלזיוס למשך 35 דקות כדי לאפשר למטריצת קרום המרתף להתפלמר. לבסוף, הוסף 500 מיקרוליטר של מדיה אורגנואיד קיבה שחומם מראש לכל באר.ביום ה-20 לאחר החניכה, אורגנואידים היו מוכנים למעבר, כפי שצוין על ידי גודל אורגנואיד גדול או פנים כהה. אורגנואידים שנותרו ללכת מעבר לנקודות אלה, החלו להתפרק לחד-שכבות דו-ממדיות. לאחר אריזה וזריעה מחדש של קיבה, הכיפות הכילו שברי אורגנואידים רבים שהתארגנו מחדש לאורגנואידים רבים יותר מהר מאוד.

Research

JoVE Journal

Biology

Routine Passaging of Patient-Derived Gastric Organoids Through Fragmentation

Establishment and Characterization of Patient-derived Gastric Organoids from Biopsies of Benign Gastric Body and Antral Epithelium

Gastric patient-derived organoids (PDOs) offer a unique tool for studying gastric biology and pathology. Consequently, these PDOs find increasing use in a ...