Überprüfung der Identität von MPNST-Zellen in der frühen Passage und Allotransplantat von Tumorzellen in der frühen Passage zum Nachweis der Tumorigenität

Legen Sie zunächst sterile Deckgläser in die Vertiefungen von Sechs-Well-Gewebekulturschalen und gießen Sie eine ausreichende Menge Poly-L-Lysin und Laminatlösung in die Vertiefungen, um das Deckglas abzudecken. Verschließen Sie die Platte anschließend mit Plastikfolie, um die Verdunstung zu begrenzen, und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Deckgläser am nächsten Morgen dreimal mit sterilem PBS.

Geben Sie zwei Milliliter Zellsuspension und Wachstumsmedien auf die Platte 10.000 Zellen in jede Vertiefung, die das Deckglas enthält. Nach dem Waschen der Deckgläser mit PBS fixieren Sie die Zellen 18 Minuten lang mit einer 4%igen Paraformaldehydlösung und PBS. Spülen Sie die Deckgläser vor der Immunfärbung fünf Minuten lang dreimal mit PBS aus.

Inkubieren Sie die immungefärbten und gewaschenen Deckgläser 10 Minuten lang in ein bis fünf Mikrogramm Hoechst-Farbstoff. Waschen Sie dann die Deckgläser weitere fünf Minuten lang mit PBS. Montieren Sie die Objektträger mit einem gleichen Verhältnis von PBS und Glyceringemisch und nehmen Sie die Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop auf.

Behandeln Sie die Zellen 30 Sekunden bis eine Minute lang mit einer nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung. Fügen Sie dann fünf Milliliter DMEM für jeden Milliliter des nicht-enzymatischen Zelldissoziationsreagenzes hinzu. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer.

Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 5G. Resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von ein- bis zweimal 10 der sechsten Zellen pro 100 Mikroliter DMEM. Legen Sie das Tier auf den Bauch und sterilisieren Sie die Injektionsstelle mit 70% Ethanol.

Injizieren Sie ein- bis zweimal 10 der sechsten Zellen subkutan in die rechte Flanke. Legen Sie die Maus allein in einen bettfreien Käfig und lassen Sie sie sich erholen. Um Unterkühlung zu vermeiden, legen Sie einen Teil des Käfigs auf das Heizkissen.

Low- und High-Power-Bilder von P0 GGF beta 3 MPNST-Zellen der frühen Passage werden gezeigt. Es wurde festgestellt, dass die Zellen tumorogen sind und Kolonien in Weichagar und Transplantate in immundefizienten Mäusen bilden.