Name: production of transgenic xenopus laevis by restriction enzyme mediated integration and nuclear transplantation
Uploaded: 2010-08-21T17:00:00
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Finanziamenti per il nostro lavoro è fornito dalla NIH, il March of Dimes, e l&#39;American Cancer Society.

Versioni modificate di questo approccio sono stati inizialmente transgenesi cui ai punti 1 e 2. A. sperma preparazione nuclei Questo metodo di preparazione dei nuclei è adattato da Murray 3, ma gli inibitori della proteasi sono stati omessi in quanto interferiscono con conseguente sviluppo di uova trapiantati con i nuclei degli spermatozoi. Aliquote sono congelati a -80 ° C e può essere utilizzato per trapianti per circa 6 mesi. ...

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	<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122, 3173-3183 (1996).</li><li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos.">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods Mol Biol. 97, 393-414 (1999).</li><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hartley, K. O., Hardcastle, Z., Friday, R. V., Amaya, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+reveal+that+anterior+neural+development+requires+continued+suppression+of+BMP+signaling+after+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos reveal that anterior neural development requires continued suppression of BMP signaling after gastrulation.</a> Developmental Biology. 238, 168-184 (2001).</li><li>Karaulanov, E., Kn&#246;chel, W., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+BMP4+synexpression+in+transgenic+Xenopus.">Transcriptional regulation of BMP4 synexpression in transgenic Xenopus.</a> EMBO J. 23, 844-856 (2004).</li><li>Ogino, H., Fisher, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+a+head-field+selector+Otx2+and+Notch+signaling:+a+mechanism+for+lens+specification.">Convergence of a head-field selector Otx2 and Notch signaling: a mechanism for lens specification.</a> Development. 135, 249-2458 (2008).</li><li>Taylor, J. J., Wang, T., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tcf-+and+Vent-binding+sites+regulate+neural-specific+geminin+expression+in+the+gastrula+embryo.">Tcf- and Vent-binding sites regulate neural-specific geminin expression in the gastrula embryo.</a> Developmental Biology. 289, 494-506 (2006).</li><li>Marsh-Armstrong, N., Huang, H., Berry, D. L., Brown, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+transgenes+in+Xenopus+laevis.">Germ-line transmission of transgenes in Xenopus laevis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14389-14393 (1999).</li><li>Offield, M. F., Hirsch, N., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Xenopus+tropicalis+transgenic+lines+and+their+use+in+studying+lens+developmental+timing+in+living+embryos.">The development of Xenopus tropicalis transgenic lines and their use in studying lens developmental timing in living embryos.</a> Development. 127, 1789-1797 (2000).</li></ol>

Per ciascun costrutto transgenico da testare, in genere trapianto nuclei in 500-1000 uova; a questa scala, possiamo generare embrioni transgenici che esprimono fino a 10 diversi costrutti al giorno, a seconda di quante donne sono indotte a deporre le uova. Di questi trapianti, circa un terzo dei fendere uova e 60-80% di questi embrioni scissione procedere attraverso gastrulazione normalmente. A seconda delle condizioni di reazione utilizzate, tra 10-50% di questi embrioni esprimono il transgene di interesse. Pertanto, u...

A. sperma preparazione nuclei Reagenti: <ol><li> 1X MMR (2mm CaCl 2, HEPES 5mm, pH7.5, 2mM KCl, 1 mM MgCl 2, 100mM NaCl). </li><li> 0,1% Tricaine metanosolfonato (MS222, aminobenzoico di etile, Sigma A-5040), bicarbonato di sodio 0,1%. Sciogliere in acqua. </li><li> 2X Burro Preparazione nucleare (NPB). Il giorno della preparazione nuclei degli spermatozoi, costituiscono il 30 ml di NPB 2X parti aliquote delle soluzioni madre conservati congelati: 500 mM saccarosio (1,5 stock M), 30 mM HEPES (stock 1M, titolare con KOH in modo che il pH 7.7 è in 15 mm), 1 mM spermidina trihydrochloride (Sigma S-2501, 10 magazzino mM), 0,4 mM tetraidrocloruro spermina (Sigma S-1141, 10 magazzino mm), 2 mM ditiotreitolo (Sigma D-0632; magazzino 100 mm), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Utilizzare il 2XNPB fare a. 30ml 1X NPB, b. 10ml 1XNPB +3% BSA (frazione V, Sigma A-7906), c. 5ml 1XNPB BSA +0,3%. </li><li> Lysolecithin: 100 ml di 10 mg / ml L-α-LYSO-lecitina, tuorlo d&#39;uovo (Calbiochem, 440154); sciogliere a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. Conservare magazzino solido a 20 ° C. Eliminare la polvere di magazzino se diventa appiccicoso. </li><li> Albumina sierica bovina (BSA): 10% (w / v) di BSA (frazione V, Sigma A-7906) Portare 5 ml di acqua il giorno della preparazione nuclei degli spermatozoi. </li><li> Spermatozoi di accumulo (1ml) 1X NPB, 30% glicerolo, 0.3% BSA. </li><li> Spermatozoi tampone di diluizione: 250 mM saccarosio, 75 mM KCl, 0,5 trihydrochloride spermidina mM, 0,2 mM tetraidrocloruro spermina. Titolare a pH 7,3-7,5 e memorizzare 0,5-1 aliquote ml a 20 ° C. </li><li> Hoechst n. 33342 (Sigma B-2261): 10 mg / ml di brodo in dH 2 O, conservare in un recipiente stretto luce a 20 ° C. </li></ol> Attrezzatura: <ul><li> Rotore oscillante e centrifuga </li><li> buratto </li><li> strumenti di dissezione (pinze e forbici) </li><li> microscopio a fluorescenza </li><li> imbuto </li><li> guanti </li><li> emocitometro </li><li> aghi (26 gauge) </li><li> asciugamani di carta </li><li> capsule di Petri (60 mm) </li><li> pipette </li><li> plastica (5 e 10 ml) </li><li> Pipetman punte (1 ml e 200μl) </li><li> Siringhe (1 ml) </li><li> Tubi (14 ml, Falcon, 2059) </li><li> Tubi </li><li> microcentrifuga (1,5 ml) </li></ul> B. Preparazione di estratto di High Speed Reagenti: <ol><li> 1X Marc modificato Ringer (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 HEPES mM, pH 7,5. Preparare uno stock 10X, e regolare il pH con NaOH a 7,5. </li><li> 20X tampone Estratto (XB) magazzino di sale: 2 M KCl, 20 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, filtro-sterilizzare e conservare a 4 ° C. </li><li> Estratto di buffer (XB, appena preparato e memorizzato sul ghiaccio): 1X sali XB, 50 mM saccarosio, HEPES 10mM (1 magazzino M, titolato con KOH in modo che il pH è di 7,7 se diluito a 15 mm, filtro-sterilizzare e conservare in aliquote a 20 ° C). Preparare circa 100 ml. </li><li> 2% (w / v) L-cisteina cloridrato 1-idrato: Made in 1X sali XB prima dell&#39;uso e titolata a pH 7.8 con NaOH. Preparare circa 300 ml. </li><li> CSF-XB: 1X sali XB, 1 mM MgCl 2 (oltre a MgCl 2 presente nel sali XB; concentrazione finale di 2 mm), 10 HEPES mM, pH 7,7, 50 mM saccarosio, 5 mM EGTA, pH 7.7. Preparare 50 ml. </li><li> Inibitori della proteasi: Miscela di leupeptina, chimostatina, e pepstatina, ogni sciolto a una concentrazione finale di 10 mg / ml in dimetilsolfossido (DMSO). Conservare in piccole aliquote a 20 ° C. </li><li> 1 M CaCl 2. </li><li> Mix energetico: 150 creatina fosfato mm, 20 mm ATP, 20 mM MgCl 2. </li><li> Incinta Mare Serum gonadotropina (PMSG): 100 U / ml PMSG (PG600 ®, Intervet, Inc., 021.825). Sciogliere in acqua e conservate a 20 ° C. </li><li> Gonadotropina corionica umana (HCG): 1000 U / ml HCG (CHORULON ®, Intervet, Inc., 057.176). Sciogliere in acqua e conservato a 4 ° C. </li></ol> Attrezzatura: <ul><li> Xenopus laevis femmine </li><li> Aghi (18 e 26 gauge) </li><li> Pipetta Pasteur </li><li> ampio foro </li><li> Siringhe (1 ml) </li><li> Tubi, microcentrifuga (0,5 ml) </li><li> Tubi, pareti spesse policarbonato (Beckman, 349622) </li><li> Tubi, UltraClear (14 x 95 mm; Beckman, 344060) </li><li> Ultracentrifuga e rotori (ad esempio, Beckman TL-100 con rotore SW 40 TLA-Ti e 100,3) </li><li> Bicchieri per la raccolta delle uova </li><li> Secchi o contenitori per lo svolgimento di rane femmine (ad esempio, 4-L bicchieri di plastica con coperchi a rete). </li></ul> C. nucleare trapianto. Reagenti: <ol><li> 2,5% di agarosio in 0.1XMMR (per fare i piatti iniezione) </li><li> 2,5% cisteina in 1XMMR, PH8.0, preparato nel giorno di utilizzo </li><li> Ficoll </li><li> 10 mg / ml di gentamicina (stock 1000X) </li><li> alta uovo estratto di velocità (vedi sopra) </li><li> 100 MgCl 2 </li><li> MMR 10X (vedi sopra) </li><li> Restrizione enzimatica (ad es Noti dal New England Biolabs) </li><li> Tampone di diluizione dello sperma (SDB, vedi sopra) e nuclei degli spermatozoi (vedi sopra) </li><li> Gonadotropina corionica umana (HCG) come sopra </li><li> olio minerale (Sigma, M8410) </li><li> Plasmide linearizzato per essere introdotto come il transgene: Preparare plasmide linearizzato ad una concentrazione di circa 100 ng / mL in sterili, acqua priva di nucleasi (evitiamo di Tris ed EDTA contenenti buffer, che sono un po &#39;tossico per gli embrioni). L&#39;enzima di restrizione utilizzato per linearizzare il plasmide non deve essere lo stesso di quello utilizzato nella reazione di trasferimento nucleare. Noi di solito utilizzare Noti per tutte le reazioni, indipendentemente da ciò che è plasmide linearizzato con. Alcuni di calibrazione della diluizione degli enzimi utilizzati nella reazione può essere necessario, enzimi come troppo può causare effetti negativi sulla post-gastrula sviluppo. Plasmide può essere purificato in diversi modi: siamo soliti utilizzare il kit di purificazione QIAquick Qiagen PCR secondo le indicazioni fabbricanti; purificazione di una singola banda da un gel non è necessario. Se il plasmide viene potabilizzata con fenolo / estrazioni cloroformio e precipitazione in etanolo, essere certi di rimuovere tutte le tracce di sostanze organiche ed etanolo. </li></ol> Attrezzatura: Piatti agarosio iniettabile: In un piatto di plastica 60 millimetri di Petri, giaceva un piccolo 35mmX35mm pesano in barca sul fuso 2,5% di agarosio in 0.1XMMR acqua per creare una depressione con un agarosio rivestite fondo per il riempimento con le uova. Una volta agarosio si è solidificato, avvolgere in parafilm e conservare a 4 ° C fino all&#39;uso. Fanno 2-3 piatti in anticipo per ogni reazione transgenici avete intenzione di fare. Pompa di infusione: Usiamo un solo pompa per infusione siringa da Harvard Apparatus, dotato di una siringa da 3 cc / ago riempito con olio minerale (Sigma M-8410). Smussato la punta dell&#39;ago della siringa (per evitare che la perforazione del tubo) e collegare il tubo Tygon multa. Funzionare la pompa a ~ 10nl/sec, questo presuppone che il tempo l&#39;ago è in ogni uovo sarà non superiore a 1 sec. Pompa deve essere pre-corsa per diversi minuti prima di transgenesi di partenza per il giorno per assicurare che il pistone per la siringa è a filo con il pistone e questo flusso costante positiva di olio dal tubo è in corso. Aghi per i trasferimenti nucleari. Con un estrattore micropipetta, generare con aghi lunghi, punte inclinata. Clip di questi con una pinza sotto un microscopio da dissezione dotato di un micrometro oculare per ottenere l&#39;apertura di 80 micron ~ con una forma smussata. Altre dotazioni: Xenopus laevis femmine, stereomicroscopio, incubatore, micromanipolatore, l&#39;ago estrattore microiniezione (es. modello P-87, Sutter), aghi di siringa (26 gauge), aghi microiniezione di vetro, micrometro oculare per il clipping calibrata di punte ad ago microiniezione di diametro 80μm, capsule di Petri, pesare barche 35mm, tubi Tygon (ID = 1 / 32 pollici, OD = 3 / 32 pollici)

production of transgenic xenopus laevis by restriction enzyme mediated integration and nuclear transplantation

Integrazione stabile dei prodotti gene clonato nel genoma Xenopus è necessario controllare il tempo e il luogo di espressione, di esprimere i geni in fasi successive dello sviluppo embrionale, e di definire come esaltatori e promotori regolare l&#39;espressione genica all&#39;interno dell&#39;embrione. Il protocollo ha dimostrato qui può essere usata per produrre in modo efficiente gli embrioni transgenici Xenopus laevis. Questo approccio transgenesi coinvolge tre parti: 1. Nuclei degli spermatozoi sono isolati da adulti X. testicolo laevis da un trattamento con lisolecitina, che permeabilizes la membrana plasmatica degli spermatozoi. 2. Estratto di uovo viene preparato mediante centrifugazione a bassa velocità, l&#39;aggiunta di calcio a causare l&#39;estratto per passare al interfase del ciclo cellulare, e una centrifugazione ad alta velocità per isolare citosol interfase. 3. Trapianto nucleare: i nuclei ed estrarre sono combinati con il DNA plasmidico linearizzato per essere introdotto come il transgene e una piccola quantità di enzima di restrizione. Durante una reazione di breve, estratto di uovo decondenses parzialmente la cromatina spermatica e l&#39;enzima di restrizione genera rotture cromosomiche che promuovono ricombinazione del transgene nel genoma. I nuclei degli spermatozoi trattati vengono poi trapiantate in uova non fecondate. L&#39;integrazione del transgene avviene di solito prima della scissione primo embrionale in modo tale che gli embrioni risultanti non sono chimerici. Questi embrioni possono essere analizzati senza necessità di allevare alla prossima generazione, permettendo per la generazione efficiente e rapido di embrioni transgenici per la ricerca di promotore e funzione del gene. Adulti X. laevis risultante da questa procedura anche propagare il transgene attraverso la linea germinale e può essere utilizzato per generare linee di animali transgenici ai fini multipli.

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Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Questo protocollo video illustra un metodo per la generazione di transgenico<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Da introduzione di transgeni in nuclei degli spermatozoi seguita da trapianto nucleare in uova non fecondate.

Produzione di transgenici Xenopus laevis Integrazione mediata da enzima di restrizione e trapianto nucleare

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Incorporare plastica e Sezionamento embrioni di Xenopus laevis

Ricerca

Biologia

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

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The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Preparazione e frazionamento di Xenopus laevis Egg Estratti

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In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

In Assemblea in vitro Nucleari Utilizzando frazionato Estratti Egg Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

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Determinazione del tessuto Utilizzando il trapianto Cap animali (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

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Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

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Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

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Dissezione dei<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cresta neurale per<em&gt; In vitro</em&gt; Espianto Cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trapianto

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Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

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Xenopus laevis come un modello per individuare Traduzione Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...