Name: production of transgenic xenopus laevis by restriction enzyme mediated integration and nuclear transplantation
Uploaded: 2010-08-21T17:00:00
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私たちの仕事のための資金は、NIH、ダイムの月、およびアメリカの癌協会によって提供されます。

このトランスジェネシスの手法の修正版は、当初1および2に記載された。 A.精子核の準備この核の調製法は、マレー3から適合されているが、それらは精子の核を移植した卵のその後の発展を妨げるとして、プロテアーゼ阻害剤が省略されている。アリコートを-80℃で凍結されており、約6ヶ月間の移植に使用することができま?...

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	<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122, 3173-3183 (1996).</li><li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos.">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods Mol Biol. 97, 393-414 (1999).</li><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hartley, K. O., Hardcastle, Z., Friday, R. V., Amaya, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+reveal+that+anterior+neural+development+requires+continued+suppression+of+BMP+signaling+after+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos reveal that anterior neural development requires continued suppression of BMP signaling after gastrulation.</a> Developmental Biology. 238, 168-184 (2001).</li><li>Karaulanov, E., Kn&#246;chel, W., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+BMP4+synexpression+in+transgenic+Xenopus.">Transcriptional regulation of BMP4 synexpression in transgenic Xenopus.</a> EMBO J. 23, 844-856 (2004).</li><li>Ogino, H., Fisher, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+a+head-field+selector+Otx2+and+Notch+signaling:+a+mechanism+for+lens+specification.">Convergence of a head-field selector Otx2 and Notch signaling: a mechanism for lens specification.</a> Development. 135, 249-2458 (2008).</li><li>Taylor, J. J., Wang, T., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tcf-+and+Vent-binding+sites+regulate+neural-specific+geminin+expression+in+the+gastrula+embryo.">Tcf- and Vent-binding sites regulate neural-specific geminin expression in the gastrula embryo.</a> Developmental Biology. 289, 494-506 (2006).</li><li>Marsh-Armstrong, N., Huang, H., Berry, D. L., Brown, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+transgenes+in+Xenopus+laevis.">Germ-line transmission of transgenes in Xenopus laevis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14389-14393 (1999).</li><li>Offield, M. F., Hirsch, N., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Xenopus+tropicalis+transgenic+lines+and+their+use+in+studying+lens+developmental+timing+in+living+embryos.">The development of Xenopus tropicalis transgenic lines and their use in studying lens developmental timing in living embryos.</a> Development. 127, 1789-1797 (2000).</li></ol>

各トランスジェニックコンストラクトがテストするために、我々は一般的に500から1000の卵に細胞核を移植し、このスケールで、我々は、産卵のた​​めに誘導する方法多くの女性に応じて、一日あたり10種類の構成要素にまで発現するトランスジェニック胚を生成することができます。これらの移植のうち、卵を切断の約3分の1と、これらの切断胚の60〜80％は、通常、原腸形成を進めます。?...

A.精子核の準備試薬： <ol><li> 1X MMR（2mMのCaCl 2を 、5mMのHEPES、pH7.5、2mMの塩化カリウム、1mMのMgCl 2を 、100mMの塩化ナトリウム）。 </li><li> 0.1パーセントTricaineメタンスルホン（MS222、アミノ安息香酸エチルエステル、シグマA - 5040）、0.1％重炭酸ナトリウム。水に溶ける。 </li><li> 2X核準備バター（NPB）。 pHが7.7になるようにKOHで滴定、500 mMスクロース（1.5 M株）、30mMのHEPES（1M株式：精子核の準備の日に、凍結保存されたストック溶液のアリコートから2X NPB 30mlを作る15mMの）、1 mMのスペルミジン塩酸塩（シグマS - 2501、10 mMストック）、0.4mMのスペルミン四塩酸塩（シグマS - 1141、10 mMストック）、2mMジチオスレイトール（シグマD - 0632、100 mMストック）、2mMのEDTA（500mMのEDTA、pH8.0）に。 </li><li> aを作るために2XNPBを使用して、 30ミリリットル1X NPB、B. 10ミリリットル1XNPB 3パーセントBSA（フラクションV、シグマ- 7906）、C. 5ミリリットル1XNPB 0.3パーセントのBSA。 </li><li>リゾレシチン：10 mg / mlのL -α-リゾレシチン、卵黄（カルビオケム、440154）の100μlのは、使用直前に室温で溶解する。 20店舗固体株式℃にそれが粘着性になった場合株式の粉を捨てる。 </li><li>ウシ血清アルブミン（BSA）：10％（w / v）のBSA（フラクションVは、シグマA - 7906）精子核の準備の日に水に5 mlをメイク。 </li><li>精子貯蔵緩衝液（1ミリリットル）1X NPB、30％グリセロール、0.3％BSA。 </li><li>精子の希釈緩衝液：250mMスクロース、75mMの塩化カリウム、0.5 mMのスペルミジン塩酸塩、0.2mMのスペルミン四塩酸塩。 pHが7.3から7.5と20店舗0.5〜1ミリリットルのアリコートに滴定℃に</li><li>ヘキスト番号33342（シグマB - 2261）：のdH 2 Oで10 mg / mlストック、20℃での光タイトな容器に保管℃に</li></ol>設備： <ul><li>スイングロータと遠心機</li><li>チーズクロス</li><li>解剖ツール（鉗子や鋏） </li><li>蛍光顕微鏡</li><li>漏斗</li><li>手袋</li><li>血球計</li><li>針（26ゲージ） </li><li>ペーパータオル</li><li>シャーレ（60 mm）の</li><li>ピペット</li><li>プラスチック（5および10 ml） </li><li> Pipetmanのヒント（1 mlおよび200μlの） </li><li>シリンジ（1ml）を</li><li>チューブ（14ミリリットル、ファルコン、2059） </li><li>チューブ</li><li>マイクロ遠心機（1.5 ml）を</li></ul>高速抽出のB.の準備試薬： <ol><li> 1X Marcの修正リンガー（MMR）：100mMのNaCl、2mMの塩化カリウム、1mMのMgCl 2、2mMのCaCl 2を 、5mMのHEPES、pH7.5の。 10Xの在庫を準備し、そしてNaOHでpHを7.5に調整する。 </li><li> 20倍の抽出バッファー（XB）塩の株式：2 M KClを、20 mMのMgCl 2、2mMのCaCl 2で 、4でろ過滅菌し、℃で保存</li><li> 1X XB塩、50 mMスクロース、10mMのHEPES緩衝（1Mストック、15 mMに希釈したときのpHは7.7であるので、KOHで滴定する。フィルター滅菌し、アリコートの店：、バッファを（新しく調製し、氷上で保存されているXB）抽出20℃）。 100ミリリットル程度の準備。 </li><li> 2％（w / v）のL -システイン塩酸塩1水和物：使用前に1X XB塩で60,600とNaOHでpH 7.8に滴定。 300ミリリットル程度の準備。 </li><li> CSF - XB：1X XB塩、1mMのMgCl 2（XB塩の2に存在して塩化マグネシウムに加え、最終濃度2 mM）を、10mMのHEPES、pH7.7の50 mMスクロース、5mMのEGTA、pHは7.7。 50mlを準備する。 </li><li>プロテアーゼ阻害剤：ロイペプチンの混合物、キモスタチン、及びペプスタチン、ジメチルスルホキシド（DMSO）に10 mg / mlの最終濃度に溶解して各。 20小アリコートで℃で保存</li><li> 1 M CaCl 2を 。 </li><li>エネルギーミックス：150mMのクレアチンリン酸、20mMのATP、20mMのMgCl 2の 。 </li><li>妊馬血清性性腺刺激ホルモン（PMSG）：100 U / mlのPMSG（PG600 ®、インター社、021825）。水に溶かし、20℃で保存</li><li>ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）：1000 U / mlのHCG（CHORULON ®、インター社、057176）。水に溶解し、4℃で保存</li></ol>設備： <ul><li> アフリカツメガエルの雌</li><li>針（18および26ゲージ） </li><li>パスツールピペット</li><li>ワイドボア</li><li>シリンジ（1 mL）を</li><li>チューブ、マイクロ遠心機（0.5 mL）を</li><li>チューブ、肉厚ポリカーボネート（ベックマン、349622） </li><li>チューブ、ultraclear（14 × 95ミリメートル、ベックマン、344060） </li><li>超遠心機とローター（例えば、ローターSW 40 TiおよびTLA - 100.3とベックマンTL - 100） </li><li>採卵用ビーカー</li><li>女性のカエルを保持するためのバケットまたは容器（例えば、メッシュの蓋付きの4 Lプラスチックビーカー）。 </li></ul> C.核移植。 試薬： <ol><li> 0.1XMMRでは2.5％アガロース（インジェクションの料理を作るための） </li><li> 1XMMRで2.5％システイン、pH8.0、使用当日に準備</li><li>フィコール</li><li> 10 mg / mlのゲンタマイシン（1000X株） </li><li>高速の卵抽出液（上記参照） </li><li> 100 MgCl 2の </li><li> 10X MMR（上記参照） </li><li>制限酵素（New England Biolabs社から例をNotI） </li><li>精子の希釈バッファー（SDB;上記参照）と精子の核（上記参照） </li><li>ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）上記のような</li><li>ミネラルオイル（Sigma社、M8410） </li><li>導入遺伝子として導入される線状化プラスミド：無菌で約100 ng /μLのヌクレアーゼフリー水（我々はトリスとEDTA含有胚に多少有毒であるバッファを、避ける）の濃度で線状化プラスミドの準備。プラスミドを線形化するために使用する制限酵素は、核移植の反応で使用されるものと同じである必要はありません。我々は通常、関係なくて直線化されたプラスミド何の、すべての反応にNotI部位を使用してください。あまりにも多くの酵素は、後の原腸胚の発達に有害影響を引き起こす可能性があるとして反応に用いる酵素の希釈のいくつかのキャリブレーションは、必要な場合があります。プラスミドは、いくつかの異なる方法で精製することができます：我々は通常、メーカーの指示に従ってキアゲンQIAクイックPCR精製キットを使用して、ゲルからの単一バンドの精製は必要ありません。プラスミドをフェノール/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を用いて精製されている場合は、有機物とエタノールの痕跡をすべて削除するようにしてください。 </li></ol>設備： 注射用アガロース料理：60ミリメートルのプラスチックペトリ皿の中では、小さな35mmX35mmが卵を埋めるためのアガロースでコーティングされた底面でうつ病を作成するには、水の0.1XMMRで溶融2.5％アガロースでボートの重量を量る置く。後は4℃でアガロースが硬化している、パラフィルムでラップして保管·使用するまで、C。あなたがする予定の各トランスジェニック反応のため、事前に2〜3皿を作る。 注入ポンプ：私たちは、ミネラルオイルで満たされた3 ccシリンジ/ニードル（シグマM - 8410）を搭載したハーバード装置、から単一のシリンジ注入ポンプを使用する。注射針の先端を（チューブを穿孔からそれを維持するために）鈍らせると細かいタイゴンチューブを取り付けます。 〜10nl/secでポンプを実行して、これは針がそれぞれの卵になっている時間は秒1より大きくなることはなることを想定しています。ポンプは、シリンジ用プランジャーは、ピストンとチューブの外油のその着実な正の流れが発生しているとぴったり重なることを保証するために前日の出発遺伝子導入へ数分のために事前に実行する必要があります。 核移転の​​ための針。マイクロピペットプラーを使用して、長く、傾斜​​した先端を持つ針を生成します。斜めの形状で〜80ミクロンの開口部を得るために接眼マイクロメータを装備した解剖顕微鏡下forcepでこれらのクリップ。 他の機器： アフリカツメガエルの女性、実体顕微鏡、インキュベーター、マイクロマニピュレータ、マイクロインジェクションニードルプラー（例：モデルP - 87、サッタ）、注射針（26ゲージ）、ガラスのマイクロインジェクションの針、80μmの直径へのマイクロインジェクションの針先のキャリブレーションクリッピングのための接眼マイクロメーター、ペトリ皿は、ボート35ミリメートル、タイゴンチューブを（ID = 1 / 32インチ、OD = 3 / 32インチ）重量

production of transgenic xenopus laevis by restriction enzyme mediated integration and nuclear transplantation

アフリカツメガエルのゲノム中にクローニングされた遺伝子産物の安定的な統合は、胚発生の後期段階で遺伝子を発現すること、およびエンハンサーおよびプロモーターは、胚内で遺伝子発現を調節する方法を定義するために、式の時間と場所を制御する必要がある。ここに示したプロトコルを効率的にトランスジェニックアフリカツメガエルの胚を生産するために使用することができます。 1：このトランスジェネシスの手法は、三つの部分を含む。精子の核は、成人Xから分離されています精子形質膜をpermeabilizesリゾレシチンで処理してツメガエル精巣、。 2。卵抽出液を低速遠心分離、抽出物は細胞周期の間期へと進行させるためにカルシウムを加え、そして相間の細胞質を分離するため、高速遠心分離によって調製される。 3。核移植：核とエキスは、導入遺伝子及び制限酵素を少量として導入される直鎖状プラスミドDNAと結合されています。短い反応中に、卵抽出物は部分的に精子クロマチンをdecondensesと制限酵素は、ゲノムへの導入遺伝子の組換えを促進する染色体切断を生成します。処理された精子の核は、未受精卵に移植されています。導入遺伝子の統合は、通常、結果として得られる胚のキメラではないというような最初の胚の切断の前に発生します。これらの胚は、プロモーターと遺伝子機能の解析のためのトランスジェニック胚の効率的かつ迅速な世代を可能にする、次の世代に繁殖することを必要とせずに解析することができます。成人X.この手順に起因するツメガエルはまた生殖細胞を通じて導入遺伝子を伝播し、複数の目的のためのトランスジェニック動物の行を生成するために使用することができます。

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Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

このビデオプロトコルは、トランスジェニックを生成する方法を示しています<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;未受精卵に核移植に続いて精子の核への導入遺伝子の導入による。

トランスジェニックの生産アフリカツメガエル制限酵素を介した統合と核移植によって

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

プラスチック製の埋め込みとアフリカツメガエル胚のセクショニング

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

アフリカツメガエル女性から卵子を入手

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

アフリカツメガエル卵抽出物の調製と分画

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

分別アフリカツメガエルの卵抽出を用いたin vitro核アセンブリで

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

でアニマルキャップの移植（ACT）アッセイを用いて組織の決定アフリカツメガエル</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

顔面移植<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

の解剖<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;神経堤のため<em&gt; in vitroで</em&gt;外植片培養又は<em&gt; in vivoで</em&gt;移植

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

アフリカツメガエルは、翻訳減損を識別するためのモデルとして、 アフリカツメガエル

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...