Name: production of transgenic xenopus laevis by restriction enzyme mediated integration and nuclear transplantation
Uploaded: 2010-08-21T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation at JoVE.com

Finansieringen av vårt arbete är från NIH, i March of Dimes, och American Cancer Society.

Modifierade versioner av denna genmodifiering metod ursprungligen som beskrivs i 1 och 2. A. Spermier kärnor förberedelse Denna kärnor förberedelse metod är anpassad från Murray 3, men proteashämmare har utelämnats eftersom de störa efterföljande utveckling av ägg transplanteras med spermier kärnor. Alikvoter är frysta vid -80 ° C och kan användas för transplantation för ca 6 månader. A...

<ol>
	<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122, 3173-3183 (1996).</li><li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos.">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods Mol Biol. 97, 393-414 (1999).</li><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hartley, K. O., Hardcastle, Z., Friday, R. V., Amaya, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+reveal+that+anterior+neural+development+requires+continued+suppression+of+BMP+signaling+after+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos reveal that anterior neural development requires continued suppression of BMP signaling after gastrulation.</a> Developmental Biology. 238, 168-184 (2001).</li><li>Karaulanov, E., Kn&#246;chel, W., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+BMP4+synexpression+in+transgenic+Xenopus.">Transcriptional regulation of BMP4 synexpression in transgenic Xenopus.</a> EMBO J. 23, 844-856 (2004).</li><li>Ogino, H., Fisher, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+a+head-field+selector+Otx2+and+Notch+signaling:+a+mechanism+for+lens+specification.">Convergence of a head-field selector Otx2 and Notch signaling: a mechanism for lens specification.</a> Development. 135, 249-2458 (2008).</li><li>Taylor, J. J., Wang, T., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tcf-+and+Vent-binding+sites+regulate+neural-specific+geminin+expression+in+the+gastrula+embryo.">Tcf- and Vent-binding sites regulate neural-specific geminin expression in the gastrula embryo.</a> Developmental Biology. 289, 494-506 (2006).</li><li>Marsh-Armstrong, N., Huang, H., Berry, D. L., Brown, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+transgenes+in+Xenopus+laevis.">Germ-line transmission of transgenes in Xenopus laevis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14389-14393 (1999).</li><li>Offield, M. F., Hirsch, N., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Xenopus+tropicalis+transgenic+lines+and+their+use+in+studying+lens+developmental+timing+in+living+embryos.">The development of Xenopus tropicalis transgenic lines and their use in studying lens developmental timing in living embryos.</a> Development. 127, 1789-1797 (2000).</li></ol>

För varje transgena konstruktion som ska testas, transplantation vi i allmänhet kärnor in 500-1000 ägg, i denna skala, kan vi skapa transgena embryon uttrycker upp till 10 olika konstruktioner per dag, beroende på hur många kvinnor lockas att lägga ägg. Av dessa transplantationer, ungefär en tredjedel av äggen klyva och 60-80% av dessa klyva embryon vidare genom gastrulation normalt. Beroende på vilken reaktionen villkor, mellan 10-50% av dessa embryon uttrycker transgenen av intresse. Därför, när detta f?...

A. Spermier kärnor förberedelse Reagens: <ol><li> 1X MMR (2mm CaCl 2, 5mm HEPES, pH7.5, 2mm KCl, 1mm MgCl 2, 100mm NaCl). </li><li> 0,1% Tricaine methanesulfonate (MS222, aminobensoesyra etylester, Sigma A-5040), 0,1% natriumbikarbonat. Lös upp i vatten. </li><li> 2X Nuclear Förberedelser Smör (NPB). På dagen av spermier atomkärnor förberedelser, utgör 30 ml 2X NPB från alikvoter av stamlösningar förvaras frysta: 500 mm sackaros (1,5 m lager), 30 mM HEPES (1M materiel, titrera med KOH, så att pH 7,7 är 15 mm), 1 mm spermidine trihydrochloride (Sigma S-2501, 10 mM lump), 0,4 mM spermine tetrahydrochloride (Sigma S-1141, 10 mM lump), 2 mm ditiotreitol (Sigma D-0632, 100 mM lump), 2 mm EDTA (500 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Använd 2XNPB att göra a. 30ml 1X NPB, f. 10ml 1XNPB 3% BSA (fraktion V, Sigma A-7906), c. 5ml 1XNPB 0,3% BSA. </li><li> Lysolecithin: 100 l 10 mg / ml L-α-lyso-Lecitin, äggula (Calbiochem, 440.154), lösa upp i rumstemperatur innan användning. Förvara fasta lager vid 20 ° C. Kasta beståndet pulvret om det blir klibbigt. </li><li> Bovint serumalbumin (BSA): 10% (w / v) BSA (fraktion V, Sigma A-7906) Fyll upp 5 ml i vatten på dagen för spermierna atomkärnor beredning. </li><li> Sperma buffert (1 ml) 1X NPB, 30% glycerol, 0,3% BSA. </li><li> Spermier spädningsbuffert: 250 mm sackaros, 75 mm KCl, 0,5 mm spermidine trihydrochloride, 0,2 mM spermine tetrahydrochloride. Titrera till pH 7,3-7,5 och spara 0,5-1 ml alikvoter vid 20 ° C. </li><li> Hoechst nr 33.342 (Sigma B-2261): 10 mg / ml lager i dH 2 O, förvara i en ljus stram fartyg vid 20 ° C. </li></ol> Utrustning: <ul><li> Swinging hink rotor och centrifugera </li><li> cheesecloth </li><li> dissektion verktyg (tång och saxar) </li><li> fluorescensmikroskop </li><li> tratt </li><li> handskar </li><li> hemocytometer </li><li> nålar (26 gauge) </li><li> pappershanddukar </li><li> petriskålar (60 mm) </li><li> pipetter </li><li> plast (5 och 10 ml) </li><li> Pipetman tips (1 ml och 200μl) </li><li> Sprutor (1 ml) </li><li> rör (14 ml, Falcon, 2059) </li><li> Rören </li><li> mikrocentrifug (1,5 ml) </li></ul> B. Beredning av High Speed ​​Utdrag Reagens: <ol><li> 1X Marc ändrade Ringer (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mm CaCl 2, 5 mm HEPES, pH 7,5. Förbered en 10X lager, och justera pH med NaOH till 7,5. </li><li> 20X Extrakt buffert (XB) salt lager: 2 M KCl, 20 mm MgCl 2, 2 mm CaCl 2, filter-sterilisera och förvara vid 4 ° C. </li><li> Utdrag buffert (XB, beredas och förvaras på is): 1X XB salter, 50 mm sackaros, 10mm HEPES (1 M lager, titreras med KOH, så att pH är 7,7 vid utspädning till 15 mm, filter-sterilisera och förvara i alikvoter vid 20 ° C). Förbered ca 100 ml. </li><li> 2% (w / v) L-Cysteine ​​hydroklorid 1-hydrate: Tillverkad i 1X XB salter före användning och titreras till pH 7,8 med NaOH. Förbered ca 300 ml. </li><li> CSF-XB: 1X XB salter, 1 mM MgCl 2 (förutom MgCl 2 finns i XB salter; slutlig koncentration 2 mm), 10 mm HEPES, pH 7,7, 50 mm sackaros, 5 mm EGTA, pH 7,7. Förbered 50 ml. </li><li> Proteashämmare: Blandning av leupeptin, chymostatin och pepstatin, var upplöst till en slutlig koncentration på 10 mg / ml i dimetylsulfoxid (DMSO). Förvaras i små portioner vid 20 ° C. </li><li> 1 M CaCl 2. </li><li> Energimix: 150 mm kreatinfosfat, 20 mm ATP, 20 mm MgCl 2. </li><li> Gravida Mare Serum gonadotropin (PMSG): 100 U / ml PMSG (PG600 ®, Intervet, Inc., 021.825). Lös i vatten och förvaras vid 20 ° C. </li><li> Humant koriongonadotropin (HCG): 1000 U / ml HCG (CHORULON ®, Intervet, Inc., 057.176). Lös i vatten och förvaras vid 4 ° C. </li></ol> Utrustning: <ul><li> Xenopus laevis kvinnor </li><li> Nålar (18 och 26 gauge) </li><li> Pasteurpipett </li><li> stort hål </li><li> Sprutor (1 ml) </li><li> Rör, mikrocentrifug (0,5 ml) </li><li> Rör, tjock vägg polykarbonat (Beckman, 349.622) </li><li> Rör, UltraClear (14 x 95 mm, Beckman, 344.060) </li><li> Ultracentrifugen och rotorer (t.ex. Beckman TL-100 med rotorer SW 40 Ti och TLA-100,3) </li><li> Bägare för insamling av ägg </li><li> Hinkar eller behållare för att hålla kvinnliga grodor (t.ex. 4-L Plastbägare mesh lock). </li></ul> C. Nuclear transplantation. Reagens: <ol><li> 2,5% agaros i 0.1XMMR (för att göra injektion rätter) </li><li> 2,5% cystein i 1XMMR, PH8.0, beredda den dag då användningen </li><li> Ficoll </li><li> 10 mg / ml gentamycin (1000X lager) </li><li> hög hastighet ägg extrakt (se ovan) </li><li> 100 MgCl 2 </li><li> 10X MPR (se ovan) </li><li> Begränsning enzym (t ex Noti från New England Biolabs) </li><li> Spermier spädningsbuffert (SDB, se ovan) och spermier kärnor (se ovan) </li><li> Humant koriongonadotropin (HCG) som ovan </li><li> mineralolja (Sigma, M8410) </li><li> Linjäriserade plasmid att införas som transgenen: Förbered linjäriserade plasmiden vid en koncentration av cirka 100 ng / l i sterila, nukleasfritt vatten (vi undviker Tris och EDTA-innehåller buffert, vilket är något giftigt för embryon). Den begränsning enzym som används för att linjärisera plasmiden behöver inte vara samma som den som används i kärnöverföring reaktion. Vi använder vanligtvis Noti för alla reaktioner, oavsett vad plasmiden är linjär med. Några kalibrering av enzymet utspädning som används i reaktionen kan vara nödvändigt, kan för mycket enzym orsaka negativa effekter på post-gastrula utveckling. Plasmid kan renas på flera olika sätt: vi brukar använda Qiagen Qiaquick PCR-rening kit enligt tillverkarens anvisningar, rening av ett enda band från en gel är inte nödvändigt. Om plasmiden renas med fenol / kloroform extraktioner och etanol nederbörd, vara säker på att avlägsna alla spår av organiska ämnen och etanol. </li></ol> Utrustning: Agarosen rätter för injektion: I en 60 mm plast petriskål, lägga en liten 35mmX35mm väger båten på smält 2,5% agaros i vatten 0.1XMMR att skapa en depression med en agaros-belagd botten för att fylla med ägg. När agaret har stelnat wrap i parafilm och förvara vid 4 ° C fram till användning. Gör 2-3 rätter i förväg för varje transgen reaktion du planerar att göra. Infusionspump: Vi använder en pump spruta infusion från Harvard Apparater, utrustad med en 3 cc spruta / nål fylld med mineralolja (Sigma M-8410). Blunt spetsen injektionsnålen (för att hålla den från att perforera slangar) och fäst den fina tygon slangen. Kör pumpen på ~ 10nl/sec, detta förutsätter att tiden nålen är i varje ägg kommer att vara större än 1 sek. Pumpen bör vara pre-run i flera minuter före start genmodifiering för dagen för att säkerställa att kolven till sprutan är jäms med kolven och att stabila, positiva flödet av olja ur slangen sker. Nålar för överföring av kärnkraft. Med hjälp av en mikropipett avdragare, generera nålar med långa, sluttande tips. Clip dessa med en forcep under ett dissekera mikroskop utrustat med en okulär mikrometer för att få en ~ 80 micron öppning med en avfasade form. Annan utrustning: Xenopus laevis honor, stereomikroskop, inkubator, mikromanipulator, mikroinjektion nål avdragare (t.ex. modell P-87, Sutter), kanyler (26 gauge), glas mikroinjektion nålar, okulär mikrometer för kalibrerade klippning av tips mikroinjektion nålen 80μm diameter, petriskålar, väga båtar 35mm, Tygon slang (ID = 1 / 32 tum, OD = 3 / 32 tum)

production of transgenic xenopus laevis by restriction enzyme mediated integration and nuclear transplantation

Stabil integration av klonade gener produkter till Xenopus genomet är nödvändigt för att styra tid och plats för uttryck, för att uttrycka gener i senare stadier av embryonal utveckling, och för att definiera hur medel och initiativtagare reglera genuttrycket i embryot. Protokollet visade här kan användas för att effektivt producera transgena Xenopus laevis embryon. Detta genmodifiering metod omfattar tre delar: 1. Spermier kärnor är isolerade från vuxna X. laevis testiklar av behandling med lysolecithin som permeabilizes spermierna plasmamembranet. 2. Ägg extrakt bereds av låg hastighet centrifugering, tillägg av kalcium för att orsaka utdraget att gå vidare till interfas av cellcykeln, och en höghastighetscentrifugering att isolera interfas cytosolen. 3. Nuclear transplantation: atomkärnor och extrahera kombineras med linjäriserade plasmid-DNA som skall införas som transgenen och en liten mängd av begränsning enzym. Under en kort reaktionstid, decondenses ägg extrahera delvis spermier kromatin och restriktionsenzymanalys genererar kromosomala pauser som främjar rekombination av transgenen i genomet. Det behandlade spermierna kärnorna är sedan transplanteras in obefruktade ägg. Integration av transgenen sker oftast före den första embryonala klyvning sådan att den resulterande embryona inte chimär. Dessa embryon kan analyseras utan att man behöver rasen till nästa generation, vilket möjliggör effektiv och snabb generering av transgena embryon för analys av promotor och geners funktion. Vuxen X. laevis följd av detta förfarande propagerar också transgenen via könsceller och kan användas för att generera rader av transgena djur för olika ändamål.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation at JoVE.com

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation (Video) | JoVE

Denna video protokoll visar en metod för att skapa transgena<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Genom införandet av transgener in spermier kärnor följt av kärnkraft transplantation till obefruktade ägg.

Produktion av Transgena Xenopus laevis Genom begränsning enzymmedierad Integration och Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos (Video) | JoVE

Plast inbäddning och Sektionering av Xenopus laevis embryon

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females (Video) | JoVE

Skaffa Ägg från Xenopus laevis Kvinnor

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts (Video) | JoVE

Upprättande och fraktionering av Xenopus laevis Egg Utdrag

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts (Video) | JoVE

In Vitro Nuclear Assembly Använda Fraktionerade Xenopus Egg Utdrag

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes (Video) | JoVE

Mikroinjektion av Xenopus laevis oocyter

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis (Video) | JoVE

Tissue Fastställande Använda Transplant Animal Cap (ACT) analys i Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis (Video) | JoVE

Live-cell imaging och kvantitativ analys av embryonala epitelceller i Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos (Video) | JoVE

Ansikts Transplantationer i<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryon

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation (Video) | JoVE

Dissekering av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest för<em&gt; In vitro</em&gt; Explantation kultur eller<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment (Video) | JoVE

Xenopus laevis som en modell för att identifiera Översättning Nedskrivningar

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...