Name: production of transgenic xenopus laevis by restriction enzyme mediated integration and nuclear transplantation
Uploaded: 2010-08-21T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation at JoVE.com

Çalışması için fonlar NIH, Dimes, Mart ve Amerikan Kanser Derneği tarafından sağlanmaktadır.

Bu transgenesis yaklaşım değiştirilmiş sürümlerini başlangıçta 1 ve 2 tarif edildi. A. sperm çekirdekleri hazırlanması Bu çekirdeklerin hazırlama yöntemi Murray 3 uyarlanmıştır, ancak sperm çekirdekleri ile nakledilen yumurta sonraki gelişmesi ile müdahale olarak proteaz inhibitörleri atlanmıştır. Alikot -80 ° C&#39;de dondurulmuş ve yaklaşık 6 ay için transplantasyon için kullanılabilir. <p clas...

<ol>
	<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122, 3173-3183 (1996).</li><li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos.">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods Mol Biol. 97, 393-414 (1999).</li><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hartley, K. O., Hardcastle, Z., Friday, R. V., Amaya, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+reveal+that+anterior+neural+development+requires+continued+suppression+of+BMP+signaling+after+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos reveal that anterior neural development requires continued suppression of BMP signaling after gastrulation.</a> Developmental Biology. 238, 168-184 (2001).</li><li>Karaulanov, E., Kn&#246;chel, W., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+BMP4+synexpression+in+transgenic+Xenopus.">Transcriptional regulation of BMP4 synexpression in transgenic Xenopus.</a> EMBO J. 23, 844-856 (2004).</li><li>Ogino, H., Fisher, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+a+head-field+selector+Otx2+and+Notch+signaling:+a+mechanism+for+lens+specification.">Convergence of a head-field selector Otx2 and Notch signaling: a mechanism for lens specification.</a> Development. 135, 249-2458 (2008).</li><li>Taylor, J. J., Wang, T., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tcf-+and+Vent-binding+sites+regulate+neural-specific+geminin+expression+in+the+gastrula+embryo.">Tcf- and Vent-binding sites regulate neural-specific geminin expression in the gastrula embryo.</a> Developmental Biology. 289, 494-506 (2006).</li><li>Marsh-Armstrong, N., Huang, H., Berry, D. L., Brown, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+transgenes+in+Xenopus+laevis.">Germ-line transmission of transgenes in Xenopus laevis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14389-14393 (1999).</li><li>Offield, M. F., Hirsch, N., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Xenopus+tropicalis+transgenic+lines+and+their+use+in+studying+lens+developmental+timing+in+living+embryos.">The development of Xenopus tropicalis transgenic lines and their use in studying lens developmental timing in living embryos.</a> Development. 127, 1789-1797 (2000).</li></ol>

Her transgenik inşa test edilmesi için, biz genel olarak 500-1000 yumurta içine çekirdekleri nakli, bu ölçekte, yumurtalarını bırakmak için ne kadar çok sayıda kadın indüklenen bağlı olarak, günde 10 kadar farklı yapıları ifade transgenik embriyolar üretebilir. Bu transplantasyon ki, yumurta tutunmaya yaklaşık üçte birini ve bu yarma embriyoların% 60-80 normalde gastrulasyon üzerinden geçin. Bu embriyoların% 10-50 arasında kullanılan reaksiyon şartlarına bağlı olarak faiz transgen ifad...

A. sperm çekirdekleri hazırlanması Reaktifler: <ol><li> 1X MMR (2mm CaCl 2, 5mM Hepes, pH7.5, 2mm KCl, 1mm MgCl 2, 100 mM NaCl). </li><li> % 0.1 Tricaine Methanesulfonate (MS222, aminobenzoik asit etil ester, Sigma A-5040),% 0.1 sodyum bikarbonat. Suda eritin. </li><li> 2X Nükleer Hazırlık Tereyağı (NPB). Sperm çekirdekleri hazırlanması gün saklandı stok çözümleri hacimde 2X NPB 30 ml makyaj: 500 mM sakkaroz (1.5 M stok), 30 mM HEPES (1M stok KOH ile titre bu pH 7.7, böylece 15 mM), 1 mM spermidin trihydrochloride (Sigma G-2501, 10 mM stok), 0.4 mM spermin tetrahydrochloride (Sigma S-1141, 10 mM stok), 2 mM dithiothreitol (Sigma D-0632, 100 mM stok), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8.0). </li><li> 2XNPB a. yapmak için kullanın. 30ml 1X NPB, b. 10ml 1XNPB +3% BSA (fraksiyon V, Sigma A-7906), c. 5ml 1XNPB +0.3% BSA. </li><li> Lysolecithin: 10 mg / ml &#39;lik L-α-lyso-Lesitin, yumurta sarısı (Calbiochem 440.154) 100 ul, sadece kullanımdan önce oda sıcaklığında çözülür. Mağaza katı stok 20 ° C Yapışkan hale gelmesi durumunda hisse senedi tozunu atın. </li><li> Sığır serum albumin (BSA):% 10 (w / v) BSA (fraksiyon V, Sigma A-7906), sperm çekirdekleri hazırlanması günü suda 5 ml olun. </li><li> Sperm depolama tamponu (1ml) 1X NPB,% 30 gliserol,% 0,3 BSA. </li><li> Sperm seyreltme tamponu: 250 mM sukroz, 75 mM KCl, 0.5 mM spermidin trihydrochloride, 0.2 mM spermin tetrahydrochloride. PH 7,3-7,5 ve mağaza 0.5-1 ml alikotları için titre 20 ° C </li><li> Hoechst No 33.342 (Sigma B-2261): 10 mg / ml stok dH 2 O ışık geçirmez bir kap içinde mağaza, 20 ° C </li></ol> Ekipman: <ul><li> Sallanır kova rotor ve santrifüj </li><li> tülbent </li><li> diseksiyon araçları (forseps ve makas) </li><li> floresan mikroskop </li><li> huni </li><li> eldiven </li><li> hemasitometre </li><li> iğneler (26 ölçü) </li><li> kağıt havlu </li><li> petri kaplarına (60 mm) </li><li> pipetler </li><li> plastik (5 ve 10 ml) </li><li> Pipetman ipuçları (1 ml ve 200μl) </li><li> Şırınga (1 ml) </li><li> tüpler (14 ml Falcon, 2059) </li><li> tüpler </li><li> mikrosantrifüj (1,5 ml) </li></ul> Yüksek Hızlı Özü B. Hazırlık Reaktifler: <ol><li> 1X Marc Modifiye Ringer (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCI, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Hepes, pH 7.5. 10X stok hazırlanması ve NaOH ile 7.5 pH ayarlamak. </li><li> 20X Extract tampon (XB) tuz stok: 2 M KCl, 20 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, filtre sterilize 4 ve mağaza ° C </li><li> Filtre sterilize ve alikotları mağaza, 15 mM seyreltilmiş böylece pH 7.7 1X XB KOH ile titre tuzlar, 50 mM sukroz, 10mM Hepes (1 M stok, tamponu (XB) taze hazırlanmış ve buz üzerinde saklanan Özü 20 ° C). 100 ml hakkında hazırlayın. </li><li> % 2 (w / v) 1-hidrat L-Sistein hidroklorür: 1X XB tuzları kullanmadan önce yapılmış ve NaOH çözeltisi ile pH 7.8 titre. 300 ml hazırlayın. </li><li> BOS-XB: 1X XB tuzları, 1 mM MgCl 2 (2 XB tuzlar mevcut MgCl yanı sıra, nihai konsantrasyonu 2 mM), 10 mM Hepes, pH 7.7, 50 mM sukroz, 5 mM EGTA, pH 7.7. 50 ml hazırlayın. </li><li> Proteaz inhibitörleri: leupeptin, chymostatin ve pepstatin, nihai konsantrasyonu 10 mg / ml dimetil sülfoksit (DMSO) çözünmüş her bir karışımı. 20 ° C küçük alikotları saklayın </li><li> 1 M CaCl 2. </li><li> Enerji karışımı: 150 mM kreatin fosfat, 20 mM ATP, 20 mM MgCl 2. </li><li> Gebe Kısrak Serum Gonadotropin (PMSG): 100 U / ml PMSG (PG600 ®, Intervet A.Ş., 021.825). Suda çözülür ve 20 ° C&#39;de saklanan </li><li> İnsan koryonik gonadotropin (HCG): (CHORULON ®, Intervet, Inc 057.176) 1000 U / ml HCG. Suda çözülür ve 4 ° C&#39;de saklanan </li></ol> Ekipman: <ul><li> Xenopus laevis kadın </li><li> Iğneler (18 ve 26 gösterge) </li><li> Pasteur pipeti </li><li> genişliğinde delik </li><li> Şırınga (1 ml) </li><li> Tüpler, mikrosantrifüj (0.5 mL) </li><li> Tüpler, kalın duvarlı polikarbonat (Beckman, 349.622) </li><li> Tüpler, ultraclear (14 x 95 mm; Beckman, 344.060) </li><li> Ultrasantrifüjdeki ve rotorlar (örneğin, Beckman ile rotorlar GB 40 Ti ve TLA-100,3 TL-100) </li><li> Yumurta toplama için bardak </li><li> Kovalar ya da dişi kurbağa (örneğin 4-L, örgü kapaklı plastik bardak) tutmak için kaplar. </li></ul> C. Nükleer nakli. Reaktifler: <ol><li> 0.1XMMR% 2.5 agaroz (enjeksiyon yemekleri yapmak için) </li><li> 1XMMR 2.5% Sistein, Kullanım günü hazırlanan pH8.0, </li><li> Ficoll </li><li> 10 mg / ml gentamisin (1000X stok) </li><li> yüksek hızda yumurta özü (yukarıya bakınız) </li><li> 100 MgCl 2 </li><li> 10X MMR (yukarıya bakınız) </li><li> Restriksiyon enzimi (New England Biolabs örneğin Noti) </li><li> Sperm seyreltme tamponu (SDB; yukarıya bakınız) ve sperm çekirdekleri (yukarıya bakınız) </li><li> İnsan koryonik gonadotropin (HCG) yukarıdaki gibi </li><li> mineral yağ (Sigma, M8410) </li><li> Transgen olarak tanıtılan plazmid lineerleştirilmiş: konsantrasyonda plazmid lineerleştirilmiş hazırlayın yaklaşık 100 ng / ml steril, nükleaz içermeyen su (biz Tris ve EDTA içeren tamponlar, embriyoların biraz toksik kaçının). Plazmid linearize kullanılan restriksiyon enzimi nükleer transfer tepki olarak kullanılan biri olarak aynı olmak zorunda değildir. Biz genellikle ile lineerleştirilmiş plazmid ne olursa olsun, tüm reaksiyonlar için Noti kullanabilirsiniz. Tepki olarak kullanılan enzim seyreltme bazı kalibrasyon gerekebilir, çok fazla enzim sonrası gastrula gelişimi üzerinde olumsuz etkilere neden olabilir. Plazmid çeşitli yollarla arındırılmalıdır: Biz genellikle üreticilerin yöne göre Qiagen Qiaquick PCR saflaştırma kiti kullanın; jel tek bir bant saflaştırılması gerekli değildir. Plazmid Eğer fenol / kloroform ekstraksiyonu ve etanol yağış, organik ve etanol tüm izlerini kaldırmak için belirli kullanarak arındırılır. </li></ol> Ekipman: Agaroz enjeksiyon için yemekler: 60 mm plastik petri, küçük bir 35mmX35mm yumurta ile doldurmak için bir agaroz kaplı alt depresyon oluşturmak için, su 0.1XMMR erimiş% 2.5 agaroz üzerinde tekne tartmak yatıyordu. 4 agaroz sertleştikten sonra, parafilm sarın ve mağaza ° C kullanana kadar. Yapmanız planladığınız her transgenik tepki için şimdiden 2-3 yemekleri olun. Infüzyon pompası: Harvard Apparatus mineral yağ ile dolu bir 3 cc şırınga / iğne ile donatılmış tek bir şırınga infüzyon pompası, (Sigma M-8410) kullanın. (Tüp perforan onu tutmak için) şırınga iğne ucu künt ve ince bir Tygon boru takın. ~ 10nl/sec pompa çalıştırın; bu iğne her bir yumurta 1 saniyeden daha fazla zaman olacağını varsayar. Pompa şırınga pistonu boru oluştuğunu piston ve petrol bu sürekli pozitif bir akış ile aynı hizada olduğundan emin olmak için gün önce başlayan transgenesis birkaç dakika için ön çalıştırılması gerekir. İğneler nükleer transferler için. Mikropipet çektirmenin kullanarak, uzun, eğimli ipuçları iğneler oluşturur. Eğimli şekli ile bir ~ 80 mikron açılış elde etmek için bir oküler mikrometre ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu altında bir forsepsle bu Klip. Diğer ekipmanlar: Xenopus laevis kadın, stereomikroskopta, inkübatör, mikromanipülatör, mikroenjeksiyon iğne çektirmesi (örneğin Model P-87, Sutter), şırınga iğne (26 gauge), cam mikroenjeksiyon iğneler, mikroenjeksiyon iğne uçları 80μm çaplı kalibre kırpma oküler mikrometre, petri kaplarına Tygon boru (ID = 1 / 32 inç OD = 3 / 32 inç), tekneler 35mm, tartmak

production of transgenic xenopus laevis by restriction enzyme mediated integration and nuclear transplantation

Xenopus genom içine klonlanmış genlerin ürünleri istikrarlı entegrasyon, ifadenin zaman ve yerde kontrol etmek, daha sonraki aşamada embriyonik gelişim genleri ifade etmek ve arttırıcılar ve destekçileri embriyo içinde gen ekspresyonu düzenleyen nasıl tanımlamak için gereklidir . Burada gösterilen protokol transgenik Xenopus laevis embriyolar verimli üretmek için kullanılabilir. 1: Bu transgenesis yaklaşım üç bölümden oluşur. Sperm çekirdekleri yetişkin X izole edilir laevis testiste sperm plazma membranı permeabilizes lysolecithin ile tedavi. 2. Yumurta özü düşük hızda santrifüj, hücre döngüsünün interfaz ilerleme özü neden ek kalsiyum ve interfaz sitoplazmada izole etmek için yüksek hızda santrifüj tarafından hazırlanmıştır. 3. Nükleer transplantasyonu: çekirdekleri ve özü transgen ve küçük bir miktar kısıtlama enzim olarak tanıtıldı Lineerleştirilmiş plazmid DNA ile birleştirilir. Kısa bir reaksiyon sırasında, yumurta ekstresi kısmen, sperm kromatin decondenses ve restriksiyon enzimi, genom, transgen rekombinasyon teşvik kromozom tatili üretir. Tedavi sperm çekirdekleri daha sonra döllenmemiş yumurta naklediliyor. Transgen Entegrasyonu genellikle önce Oluşan embriyolar kimerik olmadığı gibi ilk embriyonik bölünme oluşur. Bu embriyolar transgenik embriyoların, organizatörü ve gen fonksiyonu analizler için etkin ve hızlı bir nesil için izin veren yeni nesil, üremek için herhangi bir ihtiyaç olmadan analiz edilebilir. Yetişkin X Bu yordamı kaynaklanan laevis transgen germline yoluyla yaymak ve farklı amaçlar için transgenik hayvanlar hatları oluşturmak için kullanılan olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation at JoVE.com

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation (Video) | JoVE

Bu video protokol transgenik üretmek için bir yöntem gösteriyor<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Döllenmemiş yumurta içine nükleer transplantasyonu takiben sperm çekirdekleri transgenlerin giriş.

Transgenik, üretimi Xenopus laevis Kısıtlama Enzim aracılığı ile Entegrasyon ve Nükleer Nakli

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos (Video) | JoVE

Plastik gömülmesi ve Xenopus laevis Embriyolar Kesit

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females (Video) | JoVE

Xenopus laevis Dişiler Yumurta Alınması

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts (Video) | JoVE

Xenopus laevis Yumurta hazırlanması ve Fraksiyonu ayıklar.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts (Video) | JoVE

Vitro Nükleer Meclisi fraksiyonlara Xenopus Yumurta ayıklar kullanma

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes (Video) | JoVE

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis (Video) | JoVE

Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis (Video) | JoVE

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos (Video) | JoVE

Yüz Nakli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation (Video) | JoVE

Diseksiyonu<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Sinir Crest için<em&gt; In vitro</em&gt; Eksplantasyon Kültür veya<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantasyon

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment (Video) | JoVE

Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...