Nehmen Sie zunächst die Paraffin-Gehirnabschnitte von PFF injizierten C57 schwarzen sechs Mäusen. Entwachse die Objektträger, indem du sie in Xylolersatz tauchst und zwei Minuten lang inkubierst. Tauchen Sie die Objektträger zur Rehydrierung in 100 %, 95 % und 70 % Ethanol und dann zweimal in entionisiertes Wasser.
Füllen Sie die Proben zusammen mit doppelt destilliertem Wasser in einen mikrowellengeeigneten Behälter. Erwärmen Sie den 100-fachen Citratpuffer mit pH sechs bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie dann 350 Milliliter frischen Citratpuffer vor.
Gießen Sie den vorbereiteten Citratpuffer in einen Kunststoffbehälter mit Deckel. Legen Sie die Objektträger in den Citratpufferbehälter und sichern Sie den Deckel. Mikrowelle der Proben bei 700 Watt für vier Minuten und lassen Sie dann Zeit für eine fünfminütige Pause.
Weitere 1,5 Minuten in der Mikrowelle erhitzen, gefolgt von einer fünfminütigen Ruhezeit und den Citratpuffer auffüllen. 1,5 Minuten in der Mikrowelle erhitzen und fünf Minuten ruhen lassen. Anschließend die Proben und den Citratpuffer 20 Minuten auf Eis abkühlen lassen und mit doppelt destilliertem Wasser waschen.
Trocknen Sie die Objektträger mit einem Papiertuch, ohne das Taschentuch zu berühren. Zeichnen Sie mit einem Pap-Stift Rechtecke um die Gewebestücke. Übertragen Sie nun alle Objektträger in eine Objektträger-Immunfärbebox.
Waschen Sie sie mehrmals vorsichtig mit TBS-T und stellen Sie sicher, dass TBS-T-Tropfen in den PAP-Stiftrechtecken bleiben. Klopfen Sie die Objektträger auf ein Papiertuch, um TBS-T zu entfernen. Geben Sie 50 Mikroliter Verstopfung in jedes Rechteck und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie am Ende der Inkubation mit einem Papiertuch die Blockierungslösung aus den Proben. Pipettieren Sie vorsichtig 50 Mikroliter der primären Antikörpermischung und TBS-T in jedes Rechteck und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius. Anschließend die Objektträger mit TBS-T waschen.
Entfernen Sie das TBS-T, indem Sie auf ein Papiertuch klopfen. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. Als nächstes geben Sie 50 Mikroliter Sekundärantikörpermischung in einer Verdünnung von eins zu 1000 in TBS-T in jedes Rechteck und inkubieren bei 37 Grad Celsius für eine Stunde im Dunkeln.
Anschließend waschen Sie die Probe dreimal mit TBS-T. Inkubieren Sie die Probe dann eine Minute lang mit DAPI in einer Konzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter in TBS-T. Entfernen Sie die DAPI-Lösung, indem Sie auf ein Papiertuch klopfen, und waschen Sie sie dreimal mit TBS-T.
Um ein Glasdeckglas zu montieren, geben Sie zwei Tropfen pro Objektträger des Einbettreagenzes zu den Proben. Drücken Sie vorsichtig auf den Deckglas, um Blasen zu entfernen, und lassen Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur trocknen. Bilden Sie mindestens 50 Zellen in verschiedenen Bereichen mit einem strukturierten Beleuchtungsfluoreszenz-Bildgebungssystem ab, das mit einem 60-fachen Ölobjektiv oder einer konfokalen Technologie ausgestattet ist.
Um die Zellen zu analysieren, isolieren Sie den interessierenden Bereich, indem Sie eine Kontur um die positive oder negative Zelle zeichnen und die Zuschneidefunktion verwenden. Aktivieren Sie als Nächstes Formdeskriptoren und beschränken Sie die Optionen für den Schwellenwert in der Funktion "Messwert". Passen Sie den Schwellenwert an, indem Sie die Schwellenwertfunktion im Anpassungsmenü auswählen.
Verwenden Sie schließlich das Werkzeug Partikel analysieren und legen Sie eine geeignete Größe fest, um die Mitochondrien zu erfassen. Stellen Sie beispielsweise die Größe auf 25 unendlich ein, aktivieren Sie dann Pixeleinheiten und wählen Sie Masken anzeigen"Substanzielle Nigra Pars Compacta von PFF-injizierten Mäusen, die für Tyrosinhydroxylase VDAC1, PS129 alpha-Synuclein und DAPI gefärbt sind, werden angezeigt. Die Anti-PS129-Alpha-Synuclein-Färbung ermöglichte es, Zellen, die PS129-Läsionen beherbergten, von gesunden Zellen zu unterscheiden.
Die Bildanalyse der VDAC1-Färbung von Tyrosinhydroxylase-positiven Neuronen ergab eine Verringerung sowohl der mitochondrialen Anzahl als auch des Aspektverhältnisses zwischen Neuronen mit PS129-Läsionen und Neuronen, denen diese fehlen.
