Till att börja med tar du paraffinhjärnsektionerna av PFF-injicerade C57 svarta sex möss. Avvaxa objektglasen genom att doppa dem i xylenersättning och inkubera dem i två minuter. För rehydrering, doppa objektglasen i 100% 95% och 70% etanol och sedan två gånger i avjoniserat vatten.
Överför proverna till en behållare som kan användas i mikrovågsugn tillsammans med dubbelt destillerat vatten. Värm den 100 gånger citratbufferten med pH sex vid fyra grader Celsius. Förbered sedan 350 ml färsk citratbuffert.
Häll den förberedda citratbufferten i en plastbehållare med lock. Placera objektglasen i citratbuffertbehållaren och fäst locket. Mikrovågsugn proverna vid 700 watt i fyra minuter och låt sedan tiden vila i fem minuter.
Mikrovågsugn i ytterligare 1,5 minuter, följt av en viloperiod på fem minuter och fyll på citratbufferten. Mikrovågsugn i 1,5 minuter och låt den vila i fem minuter. Kyl sedan proverna och citratbufferten på is i 20 minuter och tvätta dem med dubbelt destillerat vatten.
Torka provglasen med en pappershandduk utan att vidröra vävnaden. Använd en pap-penna och rita rektanglar runt vävnadsbitarna. Överför nu alla objektglas till en glasimmunfärgningslåda.
Tvätta dem försiktigt flera gånger med TBS-T och se till att TBS-T-dropparna håller sig inom PAP-pennans rektanglar. Knacka på objektglasen på en pappershandduk för att ta bort TBS-T. Tillsätt 50 mikroliter blockering till varje rektangel och inkubera i en timme i rumstemperatur.
I slutet av inkubationen avlägsnar du den blockerande lösningen från proverna med hjälp av en pappershandduk. Pipettera försiktigt 50 mikroliter av den primära antikroppsblandningen och TBS-T till varje rektangel och inkubera proverna över natten vid fyra grader Celsius. Tvätta sedan objektglasen med TBS-T.
Ta bort TBS-T genom att knacka på en pappershandduk. Upprepa denna process tre gånger. Tillsätt sedan 50 mikroliter sekundär antikroppsblandning i en till 1000 utspädning i TBS-T till varje rektangel och inkubera vid 37 grader Celsius i en timme i mörker.
Tvätta sedan sample tre gånger med TBS-T. Inkubera sedan provet med DAPI i en koncentration av två mikrogram per milliliter i TBS-T i en minut. Ta bort DAPI-lösningen genom att knacka på en pappershandduk och tvätta tre gånger med TBS-T.
För att montera ett glastäcke, tillsätt två droppar per glas monteringsreagens till proverna. Tryck försiktigt på täckglaset för att eliminera bubblor och låt proverna torka i en timme i rumstemperatur. Avbilda minst 50 celler i olika fält med hjälp av ett strukturerat fluorescensavbildningssystem med belysning utrustat med ett 60 gånger oljeobjektiv eller konfokalteknik.
För att analysera cellerna, isolera området av intresse genom att rita en kontur runt den positiva eller negativa cellen och använda beskärningsfunktionen. Aktivera sedan formbeskrivningar och begränsa till tröskelalternativ i den inställda mätfunktionen. Justera tröskelnivån genom att välja tröskelfunktionen i justeringsmenyn.
Använd slutligen verktyget analysera partiklar och ställ in en lämplig storlek för att fånga mitokondrierna. Ställ till exempel in storleken på 25 oändlighet och aktivera sedan pixelenheter och välj visa masker"Betydande nigra pars compacta av PFF-injicerade möss co-aminofärgade för tyrosinhydroxylas VDAC1, PS129 alfa-synuklein och DAPI visas. Anti PS129 alfa-synukleinfärgning gjorde det möjligt att särskilja celler som hyste PS129-lesioner från friska celler.
Bildanalys av VDAC1-färgning av tyrosinhydroxylaspositiva neuroner avslöjade en minskning av både mitokondriellt antal och bildförhållande mellan neuroner som bär PS129-lesioner och neuroner som saknar dem.