Wählen Sie zunächst eine 24-Well-Platte mit Einsätzen mit 0,4-Mikron-Filtern. Geben Sie mit einer Pipette 500 Mikroliter HBSS unter und über die Filtereinsätze. Verschließen Sie dann die Multiwell-Platte und legen Sie sie für zwei Stunden in einen Inkubator.
Nach der Inkubation wird das HBSS vorsichtig von der Platte abgesaugt. Bereiten Sie eine zellfreie Kollagenlösung in einem sterilen 50-Milliliter-Röhrchen in DMEM auf Eis zu. Geben Sie 250 Mikroliter Kollagen über den Membranfilter und legen Sie den Deckel auf die Platte.
Lassen Sie die Lösung bei Raumtemperatur polymerisieren. Als nächstes entfernen Sie die L-929-Fibroblasten-Zellkultur aus dem Inkubator. Zwei Milliliter einer vorgewärmten Trypsin-EDTA-Lösung in den Kolben geben und drei bis fünf Minuten lang in einen Inkubator geben.
Die Zellsuspension wird in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen überführt und fünf Minuten lang bei 645 g zentrifugiert. Mit einer Vakuumpumpe wird der Überstand abgesaugt und das Pellet in einem Milliliter DMEM resuspendiert. Geben Sie 20 Mikroliter Zellsuspension in ein Röhrchen mit 20 Mikrolitern Trypanblaulösung.
Und verwenden Sie eine Zellzählkammer, um die Zelldichte zu bewerten. Als nächstes wird die U-937-Monozyten-Zellkultur aus dem Inkubator entnommen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter RPMI.
Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Zellen homogen suspendiert sind, zählen Sie sie mit einer Zellzählkammer. Als nächstes werden Zellsuspensionen mit 50.000 L-929- bzw. 15.000 U-937-Zellen in 50 Mikrolitern DMEM hergestellt. Geben Sie jeweils 50 Mikroliter Zellsuspension zu 450 Mikrolitern Kollagen und mischen Sie es gründlich.
Überlagern Sie die vorkodierte zellfreie Lamina propria mit 500 Mikrolitern der Kollagenzelllösung. Verschließen Sie die Platte und legen Sie sie für zwei Stunden in einen Inkubator, damit die Lösung aushärten kann. Als nächstes entnehmen Sie die Caco-2-Zellkultur aus dem Inkubator.
Saugen Sie das Medium mit einer Vakuumpumpe an und spülen Sie die Zellen mit 10 Millilitern PBS. Fügen Sie fünf Milliliter PBS-Trypsin-EDTA-Lösung hinzu und legen Sie sie für fünf bis acht Minuten in einen Inkubator. Zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter DMEM.
Nach der Zählung wird eine Zellsuspension mit 150.000 Caco-2-Zellen in 50 Mikrolitern DMEM hergestellt. Legen Sie die Platte 10 Minuten lang in eine Laminar-Flow-Haube, bevor Sie sie in den Inkubator überführen. Nach 30 Minuten werden 500 Mikroliter DMEM über das rekonstruierte Modell und 500 Mikroliter unter den Filter gegeben und die Platte wieder in den Inkubator zurückgelegt.
Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag vorsichtig durch 500 Mikroliter frisches DMEM über bzw. unter dem Filter.
