시작하려면 0.4 미크론 필터가 있는 인서트가 포함된 24웰 플레이트를 선택하십시오. 피펫을 사용하여 필터 인서트 아래와 위에 500마이크로리터의 HBSS를 추가합니다. 그런 다음 멀티웰 플레이트를 닫고 인큐베이터에 2시간 동안 넣습니다.
배양 후 플레이트에서 HBSS를 조심스럽게 흡입합니다. 무세포 콜라겐 용액을 DMEM의 멸균 50밀리리터 튜브에 얼음 위에 준비합니다. 멤브레인 필터 위에 250마이크로리터의 콜라겐을 추가하고 접시 위에 뚜껑을 놓습니다.
용액이 실온에서 중합되도록 합니다. 다음으로 인큐베이터에서 L-929 섬유아세포 배양을 제거합니다. 2 밀리리터의 예열된 트립신 EDTA 용액을 플라스크에 넣고 인큐베이터에 3-5분 동안 넣습니다.
세포 현탁액을 멸균된 15mL 튜브로 옮기고 645G에서 5분 동안 원심분리합니다. 진공 펌프를 사용하여 상층액을 흡입하고 펠릿을 1밀리리터의 DMEM에 재현탁시킵니다. 20마이크로리터의 Trypan Blue 용액이 들어 있는 튜브에 20마이크로리터의 셀 현탁액을 추가합니다.
그리고 세포 계수 챔버를 사용하여 세포 밀도를 평가합니다. 다음으로, 인큐베이터에서 U-937 단핵구 세포 배양을 제거합니다. 셀 현탁액을 원심분리하고 펠릿을 RPMI 1밀리리터로 재현탁시킵니다.
세포가 균질하게 현탁되었는지 확인한 후 세포 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다. 다음에, 50, 000의 L-929 및 15의 DMEM의 50 마이크로리터에서 000의 U-937 세포를 각각 포함하는 세포 현탁액을 준비하십시오. 각 50 마이크로리터 셀 현탁액을 450 마이크로리터의 콜라겐에 첨가하고 잘 섞습니다.
사전 코딩된 cell-free lamina propria에 500마이크로리터의 콜라겐 세포 용액을 오버레이합니다. 플레이트를 닫고 용액이 굳을 때까지 2시간 동안 인큐베이터에 넣습니다. 그런 다음 인큐베이터에서 Caco-2 세포 배양을 제거합니다.
진공 펌프를 사용하여 배지를 흡인하고 10mL의 PBS로 세포를 헹굽니다. 5 밀리리터의 PBS 트립신 EDTA 용액을 넣고 인큐베이터에 5-8 분 동안 넣으십시오. 그런 다음 셀 현탁액을 원심분리하고 펠릿을 DMEM 1밀리리터에 재현탁시킵니다.
세기 후에, DMEM의 50 마이크로리터에 있는 150, 000의 Caco-2 세포를 포함하는 세포 현탁액을 준비하십시오. 플레이트를 인큐베이터로 옮기기 전에 10분 동안 층류 후드에 놓습니다. 30분 후 재구성된 모델 위에 500마이크로리터의 DMEM을 추가하고 필터 아래에 500마이크로리터를 추가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.
다음날 배지를 필터 위와 아래에 각각 500마이크로리터의 새 DMEM으로 조심스럽게 교체합니다.