Til at begynde med skal du optø alle reagenser, der leveres i PCR-sættet i realtid ved stuetemperatur. Når de er optøet, pulser hvirvelstrømmen i 10 sekunder med moderat hastighed for at blande dem. Derefter centrifugeres ved 8.000 G i 10 sekunder ved stuetemperatur.
Opbevar de optøede komponenter på en køleblok. Forbered derefter en PCR-blanding til en HBV-positiv prøve, fem HBV-standarder og ingen skabelonkontrol. Bland grundigt de tilsatte reagenser ved forsigtigt pipettering syv til 10 gange, efterfulgt af pulshvirvelstrøm, og centrifuger ved 8.000 G i 10 sekunder ved stuetemperatur.
Derefter pipetteres 15 mikroliter PCR-blanding i hvert PCR-rør. Tilsæt 15 mikroliter ekstraheret DNA-prøve, fem HBV-standarder og nukleasefrit vand som en ingen skabelonkontrol. Luk PCR-rørene, og drej centrifugen kortvarigt.
Læg PCR-rørene i en PCR-maskine i realtid. Start nu den termiske cyklersoftware. Vælg fluorescerende farvestoffer, og programmer den termiske cyklist til PCR i realtid.
Efter kørsel skal du analysere forstærkningsplottet ved hjælp af en lineær skala. Indstil PCR-reaktionstærsklen inden for eksponentialfasen. Oprethold konsistens i tærskelindstillingerne for nøjagtighed og reproducerbarhed.
Brug den samme tærskel for alle prøver på en bestemt PCR-maskine. Overvej prøver med amplifikation før CD-værdi 38 som HBV-positive baseret på analysens cutoff. Brug fem kvantificeringsstandarder for HBV-specifikt DNA, kalibreret mod WHO's fjerde internationale standard for HBV-DNA.
Generer en standardkurve med disse standarder for at kvantificere HBV-DNA i ukendte prøver. Fortolk kun værdier for ukendte prøver, hvis standardkurvehældningen er mellem minus 3,1 og minus 3,6, R-kvadratværdien er mellem 0,99 og 1,0, PCR-effektiviteten er inden for 90% til 110%og der er ingen forstærkning i den negative kontrol.
