Name: Quantifying Hepatitis B Virus (HBV) DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR
Uploaded: 2023-12-15T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Hepatitis B Virus HBV DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR at JoVE.com

quantifying hepatitis b virus (hbv) dna in human serum samples using real-time pcr

Detectie en kwantificering van DNA van het hepatitis B-virus in humaan serum

Hepatitis B virus (HBV) is a partially double-stranded DNA virus from the genus Orthohepadnavirus and the Hepadnaviridae family1. It can trigger a chronic infection that persists throughout one&#39;s life, potentially leading to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma2,3,4. According to the World Health Organization (WHO), an estimated population of 296 million people were living with chronic hepatitis B infection in 2019, and 1.5 million people were newly infected each year5.
The identification and measurement of HBV DNA in serum or plasma samples serve as a valuable method for detecting individuals with an ongoing hepatitis B infection, assessing the efficacy of antiviral treatment, and predicting the probability of treatment success6,7,8,9,10,11. High viral load is associated with an increased risk of liver disease progression, including cirrhosis and liver cancer12,13. Hence, precise measurement of viral load is crucial for tracking the progression of HBV infection and informing decisions regarding treatment.
Quantitative real-time PCR assays have higher sensitivity, broader dynamic range, and more accurate quantification of HBV DNA than conventional PCR techniques14,15,16,17. Several commercial real-time PCR-based molecular diagnostic kits for the quantitation of HBV DNA in serum or plasma samples are available in the market. Here, we describe a detailed workflow for the detection and quantification of HBV DNA in human serum or plasma using a commercially available, IVD-marked real-time PCR-based kit. The kit is a widely used18,19, low-cost, yet highly sensitive assay, and its performance characteristics are comparable with other commercially available CE-marked kit(s)18. Apart from the HBV target region amplification, an endogenous internal control gene is also included in the kit to verify the quality of samples, quality of extracted DNA, PCR amplification, and possible PCR inhibition.

Auteur in de schijnwerpers: vooruitgang en uitdagingen bij de detectie van hepatitis B-virussen 

Real-time polymerasekettingreactie-gebaseerde detectie en kwantificering van hepatitis B-virus-DNA

In this video, we will show you a step-by-step protocol to detect HBV DNA and quantify its viral load using our IVD approved real-time PCR waste, through PCR HBV viral load kit. HBV diagnosis research uses, real time PCR, digital PCR, NGS and serological tests. Realtime PCR is the gold standard for HBV DNA detection and viral load quantification.Digital PCR quantifies absolute viral load. NGS identifies new mutations and serological tests detect antigens or antibodies. There are several experimental challenges with detecting low viral load cases and occult HBV infections.Some assays may not fall from well across all HBV genotypes and emerging new mutations may lead to false negative results. Compared to other techniques the realtime PCR based protocol is the most sensitive, specific and quantitative method available for HBV detection. It is also a relatively fast technique, which makes it ideal for clinical use.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Hepatitis B Virus HBV DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR at JoVE.com

Quantifying Hepatitis B Virus (HBV) DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR  

Kwantificering van hepatitis B-virus (HBV) DNA in menselijke serummonsters met behulp van real-time PCR

Ontdooi om te beginnen alle reagentia in de real-time PCR-kit bij kamertemperatuur. Eenmaal ontdooid, pulseer de componenten gedurende 10 seconden met een matige snelheid om ze te mengen. Centrifugeer vervolgens op 8.000 G gedurende 10 seconden bij kamertemperatuur.Bewaar de ontdooide onderdelen op een koelblok. Bereid vervolgens een PCR-mix voor een HBV-positief monster, vijf HBV-standaarden en geen sjablooncontrole. Meng de toegevoegde reagentia grondig door zeven tot tien keer zachtjes te pipetteren, gevolgd door pulsvortexen, en centrifugeer gedurende 10 seconden bij kamertemperatuur op 8.000 G.Pipetteer vervolgens 15 microliter van het PCR-mengsel in elk PCR-buisje. Voeg 15 microliter geëxtraheerd DNA-monster, vijf HBV-standaarden en nucleasevrij water toe als controle zonder sjabloon. Sluit de PCR-buisjes en draai kort in de centrifuge.Laad de PCR-buisjes in een real-time PCR-machine. Start nu de software van de thermische cycler. Kies fluorescerende kleurstoffen en programmeer de thermische cycler voor real-time PCR.Analyseer na het uitvoeren de versterkingsplot met behulp van een lineaire schaal. Stel de PCR-reactiedrempel in binnen de exponentiële fase. Zorg voor consistentie in drempelinstellingen voor nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid.Gebruik dezelfde drempelwaarde voor alle monsters op een specifieke PCR-machine. Beschouw monsters met amplificatie vóór CD-waarde 38 als HBV-positief op basis van de afkapwaarde van de test. Gebruik vijf kwantificeringsstandaarden voor HBV-specifiek DNA, gekalibreerd volgens de vierde internationale WHO-standaard voor HBV-DNA.Genereer een standaardcurve met deze standaarden om HBV-DNA in onbekende monsters te kwantificeren. Interpreteer waarden voor onbekende monsters alleen als de standaardcurvehelling tussen min 3,1 en min 3,6 ligt, de R-kwadraatwaarde tussen 0,99 en 1,0 ligt, de PCR-efficiëntie binnen 90% tot 110% ligt en er geen versterking is in de negatieve controle.