Pour commencer, décongelez tous les réactifs fournis dans le kit de PCR en temps réel à température ambiante. Une fois décongelés, pulsez les composants pendant 10 secondes à une vitesse modérée pour les mélanger. Ensuite, centrifugez à 8 000 G pendant 10 secondes à température ambiante.
Conservez les composants décongelés sur un bloc de refroidissement. Ensuite, préparez un mélange PCR pour un échantillon positif au VHB, cinq étalons pour le VHB et aucun témoin de modèle. Mélangez soigneusement les réactifs ajoutés en pipetant doucement sept à 10 fois, suivis d’un vortex pulsé et centrifugez à 8 000 G pendant 10 secondes à température ambiante.
Ensuite, pipetez 15 microlitres de mélange PCR dans chaque tube PCR. Ajoutez 15 microlitres d’échantillon d’ADN extrait, cinq étalons HBV et de l’eau exempte de nucléase comme témoin sans matrice. Fermez les tubes PCR et faites tourner brièvement la centrifugeuse.
Chargez les tubes PCR dans une machine PCR en temps réel. Maintenant, lancez le logiciel du thermocycleur. Choisissez des colorants fluorescents et programmez le thermocycleur pour la PCR en temps réel.
Après l’exécution, analysez le tracé d’amplification à l’aide d’une échelle linéaire. Définissez le seuil de réaction PCR dans la phase exponentielle. Maintenez la cohérence des paramètres de seuil pour plus de précision et de reproductibilité.
Utilisez le même seuil pour tous les échantillons d’un appareil de PCR spécifique. Considérez les échantillons avec une amplification avant la valeur CD 38 comme positifs pour le VHB en fonction de la coupure de l’essai. Utiliser cinq étalons de quantification pour l’ADN spécifique du VHB, calibrés par rapport à la quatrième norme internationale de l’OMS pour l’ADN du VHB.
Générez une courbe standard avec ces étalons pour quantifier l’ADN du VHB dans des échantillons inconnus. Interpréter les valeurs des échantillons inconnus uniquement si la pente de la courbe standard est comprise entre moins 3,1 et moins 3,6, si la valeur R au carré est comprise entre 0,99 et 1,0, si l’efficacité de la PCR est comprise entre 90 % et 110 % et s’il n’y a pas d’amplification dans le témoin négatif.
