Name: Quantifying Hepatitis B Virus (HBV) DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR
Uploaded: 2023-12-15T14:50:00
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quantifying hepatitis b virus (hbv) dna in human serum samples using real-time pcr

인간 혈청에서 B형 간염 바이러스 DNA의 검출 및 정량화

Hepatitis B virus (HBV) is a partially double-stranded DNA virus from the genus Orthohepadnavirus and the Hepadnaviridae family1. It can trigger a chronic infection that persists throughout one&#39;s life, potentially leading to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma2,3,4. According to the World Health Organization (WHO), an estimated population of 296 million people were living with chronic hepatitis B infection in 2019, and 1.5 million people were newly infected each year5.
The identification and measurement of HBV DNA in serum or plasma samples serve as a valuable method for detecting individuals with an ongoing hepatitis B infection, assessing the efficacy of antiviral treatment, and predicting the probability of treatment success6,7,8,9,10,11. High viral load is associated with an increased risk of liver disease progression, including cirrhosis and liver cancer12,13. Hence, precise measurement of viral load is crucial for tracking the progression of HBV infection and informing decisions regarding treatment.
Quantitative real-time PCR assays have higher sensitivity, broader dynamic range, and more accurate quantification of HBV DNA than conventional PCR techniques14,15,16,17. Several commercial real-time PCR-based molecular diagnostic kits for the quantitation of HBV DNA in serum or plasma samples are available in the market. Here, we describe a detailed workflow for the detection and quantification of HBV DNA in human serum or plasma using a commercially available, IVD-marked real-time PCR-based kit. The kit is a widely used18,19, low-cost, yet highly sensitive assay, and its performance characteristics are comparable with other commercially available CE-marked kit(s)18. Apart from the HBV target region amplification, an endogenous internal control gene is also included in the kit to verify the quality of samples, quality of extracted DNA, PCR amplification, and possible PCR inhibition.

저자 스포트라이트: B형 간염 바이러스 검출의 발전과 과제 

B형 간염 바이러스 DNA의 실시간 중합효소 연쇄 반응 기반 검출 및 정량

In this video, we will show you a step-by-step protocol to detect HBV DNA and quantify its viral load using our IVD approved real-time PCR waste, through PCR HBV viral load kit. HBV diagnosis research uses, real time PCR, digital PCR, NGS and serological tests. Realtime PCR is the gold standard for HBV DNA detection and viral load quantification.Digital PCR quantifies absolute viral load. NGS identifies new mutations and serological tests detect antigens or antibodies. There are several experimental challenges with detecting low viral load cases and occult HBV infections.Some assays may not fall from well across all HBV genotypes and emerging new mutations may lead to false negative results. Compared to other techniques the realtime PCR based protocol is the most sensitive, specific and quantitative method available for HBV detection. It is also a relatively fast technique, which makes it ideal for clinical use.

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Quantifying Hepatitis B Virus (HBV) DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR  

Real-Time PCR을 사용한 인간 혈청 샘플의 B형 간염 바이러스(HBV) DNA 정량

먼저 Real-Time PCR 키트에 제공된 모든 시약을 실온에서 해동합니다. 해동되면 구성 요소를 적당한 속도로 10초 동안 펄스 소용돌이로 하여 혼합합니다. 그 후에, 8에 분리기, 실내 온도에 10 초 동안 000G.해동된 구성 요소를 냉각 블록에 보관하십시오. 다음으로, HBV 양성 샘플, 5가지 HBV 표준물질 및 템플릿 대조군이 없는 것에 대한 PCR 믹스를 준비합니다. 완전히 온화하게 7 10 시간을, 팔박 소용돌이에 선행된 피펫팅해서 추가한 시약을 섞고, 8에 의 실내 온도에 10 초 동안 000G를 분리하십시오.그런 다음 15 마이크로 리터의 PCR을 피펫팅하여 각 PCR 튜브에 혼합합니다. 추출된 DNA 샘플 15마이크로리터, HBV 표준물질 5개, 뉴클레아제가 없는 물을 무형으로 추가합니다. PCR 튜브를 닫고 원심분리기에서 잠시 회전합니다.Real-Time PCR 기계에 PCR 튜브를 로드합니다. 이제 열 순환기 소프트웨어를 시작하십시오. 형광 염료를 선택하고 Real-Time PCR을 위해 열 순환기를 프로그래밍합니다.실행 후 선형 스케일을 사용하여 증폭 플롯을 분석합니다. 지수 단계 내에서 PCR 반응 임계값을 설정합니다. 정확도와 재현성을 위해 임계값 설정에서 일관성을 유지합니다.특정 PCR 기계의 모든 샘플에 대해 동일한 임계값을 사용합니다. CD 값 38 이전에 증폭된 샘플은 분석의 컷오프에 따라 HBV 양성으로 간주합니다. HBV DNA에 대한 제4차 WHO 국제 표준물질에 따라 보정된 HBV 특이적 DNA에 대한 5가지 정량 표준물질을 사용합니다.이러한 표준물질로 표준 곡선을 생성하여 미지의 샘플에서 HBV DNA를 정량화할 수 있습니다. 표준 곡선 기울기가 마이너스 3.1에서 마이너스 3.6 사이이고, R 제곱 값이 0.99에서 1.0 사이이고, PCR 효율이 90%에서 110% 이내이고, 음성 대조군에 증폭이 없는 경우에만 알려지지 않은 샘플에 대한 값을 해석합니다.