Name: Quantifying Hepatitis B Virus (HBV) DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR
Uploaded: 2023-12-15T14:50:00
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quantifying hepatitis b virus (hbv) dna in human serum samples using real-time pcr

Detecção e quantificação do DNA do vírus da hepatite B no soro humano

Hepatitis B virus (HBV) is a partially double-stranded DNA virus from the genus Orthohepadnavirus and the Hepadnaviridae family1. It can trigger a chronic infection that persists throughout one&#39;s life, potentially leading to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma2,3,4. According to the World Health Organization (WHO), an estimated population of 296 million people were living with chronic hepatitis B infection in 2019, and 1.5 million people were newly infected each year5.
The identification and measurement of HBV DNA in serum or plasma samples serve as a valuable method for detecting individuals with an ongoing hepatitis B infection, assessing the efficacy of antiviral treatment, and predicting the probability of treatment success6,7,8,9,10,11. High viral load is associated with an increased risk of liver disease progression, including cirrhosis and liver cancer12,13. Hence, precise measurement of viral load is crucial for tracking the progression of HBV infection and informing decisions regarding treatment.
Quantitative real-time PCR assays have higher sensitivity, broader dynamic range, and more accurate quantification of HBV DNA than conventional PCR techniques14,15,16,17. Several commercial real-time PCR-based molecular diagnostic kits for the quantitation of HBV DNA in serum or plasma samples are available in the market. Here, we describe a detailed workflow for the detection and quantification of HBV DNA in human serum or plasma using a commercially available, IVD-marked real-time PCR-based kit. The kit is a widely used18,19, low-cost, yet highly sensitive assay, and its performance characteristics are comparable with other commercially available CE-marked kit(s)18. Apart from the HBV target region amplification, an endogenous internal control gene is also included in the kit to verify the quality of samples, quality of extracted DNA, PCR amplification, and possible PCR inhibition.

Autor em destaque: Avanços e desafios na detecção do vírus da hepatite B 

Detecção e quantificação em tempo real do DNA do vírus da hepatite B baseado na reação em cadeia da polimerase

In this video, we will show you a step-by-step protocol to detect HBV DNA and quantify its viral load using our IVD approved real-time PCR waste, through PCR HBV viral load kit. HBV diagnosis research uses, real time PCR, digital PCR, NGS and serological tests. Realtime PCR is the gold standard for HBV DNA detection and viral load quantification.Digital PCR quantifies absolute viral load. NGS identifies new mutations and serological tests detect antigens or antibodies. There are several experimental challenges with detecting low viral load cases and occult HBV infections.Some assays may not fall from well across all HBV genotypes and emerging new mutations may lead to false negative results. Compared to other techniques the realtime PCR based protocol is the most sensitive, specific and quantitative method available for HBV detection. It is also a relatively fast technique, which makes it ideal for clinical use.

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Quantifying Hepatitis B Virus (HBV) DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR  

Quantificação do DNA do vírus da hepatite B (HBV) em amostras de soro humano por PCR em tempo real

Para começar, descongele todos os reagentes fornecidos no kit de PCR em tempo real à temperatura ambiente. Uma vez descongelados, pulse os componentes por 10 segundos a uma velocidade moderada para misturá-los. Em seguida, centrifugar a 8.000G por 10 segundos à temperatura ambiente.Mantenha os componentes descongelados em um bloco de resfriamento. Em seguida, prepare uma mistura de PCR para uma amostra positiva para HBV, cinco padrões de HBV e nenhum controle de modelo. Misture bem os reagentes adicionados pipetando suavemente sete a 10 vezes, seguido de vórtice de pulso, e centrifugando a 8.000G por 10 segundos à temperatura ambiente.Em seguida, pipetar 15 microlitros da mistura de PCR em cada tubo de PCR. Adicione 15 microlitros de amostra de DNA extraída, cinco padrões de HBV e água livre de nuclease como um controle sem modelo. Feche os tubos de PCR e gire brevemente na centrífuga.Carregue os tubos de PCR em uma máquina de PCR em tempo real. Agora, inicie o software termociclador. Escolha corantes fluorescentes e programe o termociclador para PCR em tempo real.Após a execução, analise o gráfico de amplificação usando uma escala linear. Defina o limite de reação de PCR dentro da fase exponencial. Mantenha a consistência nas configurações de limite para precisão e reprodutibilidade.Use o mesmo limite para todas as amostras em uma máquina de PCR específica. Considerar amostras com amplificação antes do valor 38 do CD como HBV positivo com base no ponto de corte do ensaio. Use cinco padrões de quantificação para DNA específico do HBV, calibrados de acordo com o quarto padrão internacional da OMS para o DNA do HBV.Gere uma curva padrão com esses padrões para quantificar o DNA do HBV em amostras desconhecidas. Interpretar valores para amostras desconhecidas somente se a inclinação da curva padrão estiver entre menos 3,1 e menos 3,6, o valor do R quadrado estiver entre 0,99 e 1,0, a eficiência da PCR estiver entre 90% a 110% e não houver amplificação no controle negativo.