Name: Quantifying Hepatitis B Virus (HBV) DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR
Uploaded: 2023-12-15T14:50:00
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quantifying hepatitis b virus (hbv) dna in human serum samples using real-time pcr

Detección y cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B en suero humano

Hepatitis B virus (HBV) is a partially double-stranded DNA virus from the genus Orthohepadnavirus and the Hepadnaviridae family1. It can trigger a chronic infection that persists throughout one&#39;s life, potentially leading to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma2,3,4. According to the World Health Organization (WHO), an estimated population of 296 million people were living with chronic hepatitis B infection in 2019, and 1.5 million people were newly infected each year5.
The identification and measurement of HBV DNA in serum or plasma samples serve as a valuable method for detecting individuals with an ongoing hepatitis B infection, assessing the efficacy of antiviral treatment, and predicting the probability of treatment success6,7,8,9,10,11. High viral load is associated with an increased risk of liver disease progression, including cirrhosis and liver cancer12,13. Hence, precise measurement of viral load is crucial for tracking the progression of HBV infection and informing decisions regarding treatment.
Quantitative real-time PCR assays have higher sensitivity, broader dynamic range, and more accurate quantification of HBV DNA than conventional PCR techniques14,15,16,17. Several commercial real-time PCR-based molecular diagnostic kits for the quantitation of HBV DNA in serum or plasma samples are available in the market. Here, we describe a detailed workflow for the detection and quantification of HBV DNA in human serum or plasma using a commercially available, IVD-marked real-time PCR-based kit. The kit is a widely used18,19, low-cost, yet highly sensitive assay, and its performance characteristics are comparable with other commercially available CE-marked kit(s)18. Apart from the HBV target region amplification, an endogenous internal control gene is also included in the kit to verify the quality of samples, quality of extracted DNA, PCR amplification, and possible PCR inhibition.

Autor destacado: Avances y desafíos en la detección del virus de la hepatitis B 

Detección y cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B basada en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

In this video, we will show you a step-by-step protocol to detect HBV DNA and quantify its viral load using our IVD approved real-time PCR waste, through PCR HBV viral load kit. HBV diagnosis research uses, real time PCR, digital PCR, NGS and serological tests. Realtime PCR is the gold standard for HBV DNA detection and viral load quantification.Digital PCR quantifies absolute viral load. NGS identifies new mutations and serological tests detect antigens or antibodies. There are several experimental challenges with detecting low viral load cases and occult HBV infections.Some assays may not fall from well across all HBV genotypes and emerging new mutations may lead to false negative results. Compared to other techniques the realtime PCR based protocol is the most sensitive, specific and quantitative method available for HBV detection. It is also a relatively fast technique, which makes it ideal for clinical use.

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Quantifying Hepatitis B Virus (HBV) DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR  

Cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B (VHB) en muestras de suero humano mediante PCR en tiempo real

Para comenzar, descongele todos los reactivos proporcionados en el kit de PCR en tiempo real a temperatura ambiente. Una vez descongelados, pulsa los componentes durante 10 segundos a una velocidad moderada para mezclarlos. Luego, centrifugar a 8, 000 G durante 10 segundos a temperatura ambiente.Mantenga los componentes descongelados en un bloque de enfriamiento. A continuación, prepare una mezcla de PCR para una muestra positiva de VHB, cinco estándares de VHB y ningún control de plantilla. Mezcle bien los reactivos agregados pipeteando suavemente de siete a 10 veces, seguido de un vórtice de pulsos, y centrifugue a 8.000 G durante 10 segundos a temperatura ambiente.A continuación, pipetee 15 microlitros de la mezcla de PCR en cada tubo de PCR. Agregue 15 microlitros de muestra de ADN extraída, cinco patrones de VHB y agua libre de nucleasas como control sin plantilla. Cierre los tubos de PCR y gire brevemente en la centrífuga.Cargue los tubos de PCR en una máquina de PCR en tiempo real. Ahora, inicie el software del termociclador. Elija tintes fluorescentes y programe el termociclador para la PCR en tiempo real.Después de la ejecución, analice el gráfico de amplificación utilizando una escala lineal. Establezca el umbral de reacción de PCR dentro de la fase exponencial. Mantenga la coherencia en la configuración de los umbrales para mayor precisión y reproducibilidad.Utilice el mismo umbral para todas las muestras de una máquina de PCR específica. Considere las muestras con amplificación antes del valor de CD 38 como positivas para el VHB según el punto de corte del ensayo. Utilizar cinco patrones de cuantificación para el ADN específico del VHB, calibrados con respecto al Cuarto estándar internacional de la OMS para el ADN del VHB.Genere una curva estándar con estos estándares para cuantificar el ADN del VHB en muestras desconocidas. Interprete los valores de las muestras desconocidas solo si la pendiente de la curva estándar está entre menos 3,1 y menos 3,6, el valor R cuadrado está entre 0,99 y 1,0, la eficiencia de la PCR está entre el 90 % y el 110 % y no hay amplificación en el control negativo.