Name: Quantifying Hepatitis B Virus (HBV) DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR
Uploaded: 2023-12-15T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Hepatitis B Virus HBV DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR at JoVE.com

quantifying hepatitis b virus (hbv) dna in human serum samples using real-time pcr

Detektion och kvantifiering av hepatit B-virus-DNA i humant serum

Hepatitis B virus (HBV) is a partially double-stranded DNA virus from the genus Orthohepadnavirus and the Hepadnaviridae family1. It can trigger a chronic infection that persists throughout one&#39;s life, potentially leading to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma2,3,4. According to the World Health Organization (WHO), an estimated population of 296 million people were living with chronic hepatitis B infection in 2019, and 1.5 million people were newly infected each year5.
The identification and measurement of HBV DNA in serum or plasma samples serve as a valuable method for detecting individuals with an ongoing hepatitis B infection, assessing the efficacy of antiviral treatment, and predicting the probability of treatment success6,7,8,9,10,11. High viral load is associated with an increased risk of liver disease progression, including cirrhosis and liver cancer12,13. Hence, precise measurement of viral load is crucial for tracking the progression of HBV infection and informing decisions regarding treatment.
Quantitative real-time PCR assays have higher sensitivity, broader dynamic range, and more accurate quantification of HBV DNA than conventional PCR techniques14,15,16,17. Several commercial real-time PCR-based molecular diagnostic kits for the quantitation of HBV DNA in serum or plasma samples are available in the market. Here, we describe a detailed workflow for the detection and quantification of HBV DNA in human serum or plasma using a commercially available, IVD-marked real-time PCR-based kit. The kit is a widely used18,19, low-cost, yet highly sensitive assay, and its performance characteristics are comparable with other commercially available CE-marked kit(s)18. Apart from the HBV target region amplification, an endogenous internal control gene is also included in the kit to verify the quality of samples, quality of extracted DNA, PCR amplification, and possible PCR inhibition.

Författare i fokus: Framsteg och utmaningar inom upptäckt av hepatit B-virus 

Polymeraskedjereaktionsbaserad detektion och kvantifiering av hepatit B-virus-DNA i realtid

In this video, we will show you a step-by-step protocol to detect HBV DNA and quantify its viral load using our IVD approved real-time PCR waste, through PCR HBV viral load kit. HBV diagnosis research uses, real time PCR, digital PCR, NGS and serological tests. Realtime PCR is the gold standard for HBV DNA detection and viral load quantification.Digital PCR quantifies absolute viral load. NGS identifies new mutations and serological tests detect antigens or antibodies. There are several experimental challenges with detecting low viral load cases and occult HBV infections.Some assays may not fall from well across all HBV genotypes and emerging new mutations may lead to false negative results. Compared to other techniques the realtime PCR based protocol is the most sensitive, specific and quantitative method available for HBV detection. It is also a relatively fast technique, which makes it ideal for clinical use.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Hepatitis B Virus HBV DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR at JoVE.com

Quantifying Hepatitis B Virus (HBV) DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR  

Kvantifiering av hepatit B-virus (HBV) DNA i humana serumprover med hjälp av realtids-PCR

Till att börja med, tina alla reagenser som tillhandahålls i realtids-PCR-kitet vid rumstemperatur. När de har tinats, pulsvirvla komponenterna i 10 sekunder med måttlig hastighet för att blanda dem. Centrifugera sedan vid 8 000 G i 10 sekunder vid rumstemperatur.Förvara de tinade komponenterna på ett kylblock. Förbered sedan en PCR-blandning för ett HBV-positivt prov, fem HBV-standarder och ingen mallkontroll. Blanda de tillsatta reagenserna noggrant genom att försiktigt pipettera sju till 10 gånger, följt av pulsvirvling, och centrifugera vid 8 000 G i 10 sekunder vid rumstemperatur.Pipettera sedan 15 mikroliter av PCR-blandningen i varje PCR-rör. Lägg till 15 mikroliter extraherat DNA-prov, fem HBV-standarder och nukleasfritt vatten som en kontroll utan mall. Stäng PCR-rören och snurra kort i centrifugen.Ladda PCR-rören i en realtids-PCR-maskin. Starta nu programvaran för termisk cykler. Välj fluorescerande färgämnen och programmera termocyklern för realtids-PCR.Efter körning, analysera förstärkningsdiagrammet med hjälp av en linjär skala. Ställ in PCR-reaktionströskeln inom den exponentiella fasen. Upprätthåll konsekvens i tröskelvärdesinställningarna för noggrannhet och reproducerbarhet.Använd samma tröskelvärde för alla prover på en specifik PCR-maskin. Betrakta prover med amplifiering före CD-värde 38 som HBV-positiva baserat på analysens cutoff. Använd fem kvantifieringsstandarder för HBV-specifikt DNA, kalibrerade mot WHO:s fjärde internationella standard för HBV-DNA.Generera en standardkurva med dessa standarder för att kvantifiera HBV-DNA i okända prover. Tolka värden för okända prover endast om standardkurvans lutning är mellan minus 3,1 och minus 3,6, R-kvadratvärdet är mellan 0,99 och 1,0, PCR-effektiviteten ligger inom 90 % till 110 % och det inte finns någon förstärkning i den negativa kontrollen.