Name: Quantifying Hepatitis B Virus (HBV) DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR
Uploaded: 2023-12-15T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Hepatitis B Virus HBV DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR at JoVE.com

quantifying hepatitis b virus (hbv) dna in human serum samples using real-time pcr

İnsan Serumunda Hepatit B Virüsü DNA'sının Tespiti ve Miktar Tayini

Hepatitis B virus (HBV) is a partially double-stranded DNA virus from the genus Orthohepadnavirus and the Hepadnaviridae family1. It can trigger a chronic infection that persists throughout one&#39;s life, potentially leading to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma2,3,4. According to the World Health Organization (WHO), an estimated population of 296 million people were living with chronic hepatitis B infection in 2019, and 1.5 million people were newly infected each year5.
The identification and measurement of HBV DNA in serum or plasma samples serve as a valuable method for detecting individuals with an ongoing hepatitis B infection, assessing the efficacy of antiviral treatment, and predicting the probability of treatment success6,7,8,9,10,11. High viral load is associated with an increased risk of liver disease progression, including cirrhosis and liver cancer12,13. Hence, precise measurement of viral load is crucial for tracking the progression of HBV infection and informing decisions regarding treatment.
Quantitative real-time PCR assays have higher sensitivity, broader dynamic range, and more accurate quantification of HBV DNA than conventional PCR techniques14,15,16,17. Several commercial real-time PCR-based molecular diagnostic kits for the quantitation of HBV DNA in serum or plasma samples are available in the market. Here, we describe a detailed workflow for the detection and quantification of HBV DNA in human serum or plasma using a commercially available, IVD-marked real-time PCR-based kit. The kit is a widely used18,19, low-cost, yet highly sensitive assay, and its performance characteristics are comparable with other commercially available CE-marked kit(s)18. Apart from the HBV target region amplification, an endogenous internal control gene is also included in the kit to verify the quality of samples, quality of extracted DNA, PCR amplification, and possible PCR inhibition.

Yazar Spotlight: Hepatit B Virüsü Tespitindeki Gelişmeler ve Zorluklar 

Hepatit B Virüsü DNA'sının Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Tabanlı Tespiti ve Miktar Tayini

In this video, we will show you a step-by-step protocol to detect HBV DNA and quantify its viral load using our IVD approved real-time PCR waste, through PCR HBV viral load kit. HBV diagnosis research uses, real time PCR, digital PCR, NGS and serological tests. Realtime PCR is the gold standard for HBV DNA detection and viral load quantification.Digital PCR quantifies absolute viral load. NGS identifies new mutations and serological tests detect antigens or antibodies. There are several experimental challenges with detecting low viral load cases and occult HBV infections.Some assays may not fall from well across all HBV genotypes and emerging new mutations may lead to false negative results. Compared to other techniques the realtime PCR based protocol is the most sensitive, specific and quantitative method available for HBV detection. It is also a relatively fast technique, which makes it ideal for clinical use.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Hepatitis B Virus HBV DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR at JoVE.com

Quantifying Hepatitis B Virus (HBV) DNA in Human Serum Samples Using Real-Time PCR  

İnsan Serum Örneklerinde Hepatit B Virüsü (HBV) DNA'sının Gerçek Zamanlı PCR Kullanılarak Ölçülmesi

Başlamak için, gerçek zamanlı PCR kitinde sağlanan tüm reaktifleri oda sıcaklığında çözün. Çözüldükten sonra, bileşenleri karıştırmak için orta hızda 10 saniye boyunca nabız yapın. Ardından, oda sıcaklığında 10 saniye boyunca 8.000G'de santrifüjleyin.Çözülmüş bileşenleri bir soğutma bloğunda tutun. Ardından, bir HBV pozitif numune, beş HBV standardı ve şablon kontrolü olmadan bir PCR karışımı hazırlayın. Eklenen reaktifleri yedi ila 10 kez hafifçe pipetleyerek, ardından nabız vortekslemesi yaparak iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 saniye boyunca 8.000G'de santrifüjleyin.Ardından, her bir PCR tüpüne 15 mikrolitre PCR karışımı pipetleyin. 15 mikrolitre ekstrakte edilmiş DNA örneği, beş HBV standardı ve şablon kontrolü olmayan nükleaz içermeyen su ekleyin. PCR tüplerini kapatın ve santrifüjde kısa bir süre döndürün.PCR tüplerini gerçek zamanlı bir PCR makinesine yükleyin. Şimdi, termal döngüleyici yazılımını başlatın. Floresan boyaları seçin ve termal döngüleyiciyi gerçek zamanlı PCR için programlayın.Çalıştırma sonrası, doğrusal bir ölçek kullanarak amplifikasyon grafiğini analiz edin. Üstel faz içinde PCR reaksiyon eşiğini ayarlayın. Doğruluk ve tekrarlanabilirlik için eşik ayarlarında tutarlılığı koruyun.Belirli bir PCR makinesindeki tüm numuneler için aynı eşiği kullanın. Amplifikasyonu CD değeri 38'den önce olan numuneleri, testin sınırına göre HBV pozitif olarak düşünün. HBV'ye özgü DNA için, HBV DNA için Dördüncü DSÖ uluslararası standardına göre kalibre edilmiş beş miktar tayini standardı kullanın.Bilinmeyen örneklerde HBV DNA'sını ölçmek için bu standartlarla standart bir eğri oluşturun. Bilinmeyen numuneler için değerleri yalnızca standart eğri eğimi eksi 3.1 ile eksi 3.6 arasındaysa, R kare değeri 0.99 ile 1.0 arasındaysa, PCR verimliliği %90 ila %110 arasındaysa ve negatif kontrolde amplifikasyon yoksa yorumlayın.