Name: Bildanalyse zur Charakterisierung des Mitochondriennetzwerks von ganzen Neuronen
Uploaded: 2023-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Image Analysis for Characterizing Whole-Neuron Mitochondria Network at JoVE.com

image analysis for characterizing whole-neuron mitochondria network

MATLAB-Optimierung zur Analyse mitochondrialer Netzwerke in den Neurowissenschaften

Cellular mitochondria sit at the center of all physiological states, and a thorough understanding of their homeostasis (mitostasis) and behavior is paramount to assist in identifying pharmacological treatment for a wide range of illnesses, including cancer and Alzheimer&#39;s disease1,2.
Mitochondria play crucial cellular roles in energy homeostasis, ATP generation, calcium buffering, and ROS regulation, and mitostasis is essential for maintaining protein homeostasis as molecular chaperones are energy-dependent3. These require a constant and dynamic network modulation and adaptation to efficiently meet cellular needs, and mitochondria transport is regulated by different signaling pathways; previous work has described one such pathway, that of retinoic acid receptors (RARs)4,5. Retinoic acid (RA) promotes axonal and neurite outgrowth via RAR activation. In mouse primary cortical neurons, activation of RAR-&#946; encourages mitochondrial growth, speed, and mobility in the neurite6.
Considering the mitochondrial network adaptability and dynamics, the possibility of assessing mitostasis in &#34;real time&#34; is essential not only for investigating energy homeostasis, but also for proteostasis, cellular health, proliferation, or signaling. A commonly used method for evaluating mitostasis relies on confocal microscopy after highlighting mitochondria using a fluorescent dye or marker, as well as a specific microscopy setup allowing temperature and/or CO2 regulation7. This type of experimental setup entails that one experimental replicate be performed at a time. In addition to experimental repetition of different treatments, it should be considered that most experiments should have their technical replicates (where more than one position is imaged per plate), with a series of focal planes (z-stacks) being recorded in a series of time points. Thus, an experimental design with three repetitions of one control and two treatments, with five imaging positions per plate, and 15 time points, results in 225 stacks to be processed. Classically, videos of live mitochondria were analyzed by plotting kymographs, which would be individually analyzed8, in a time-consuming process requiring extensive manual input, even when relying on computer tools.
An algorithm was recently described9 that allows automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell 2-D and 3-D time-lapse files. Other quantification techniques are available, and all have their limitations10. Mitometer, an automated open-source application, is particularly adequate for time lapse and mitochondria dynamics analysis, requiring low user input. This application has a series of advantages over other existing MATLAB-based tools, namely allowing the automatic processing of individual TIF stacks, using up to 13 different parameters, particularly interesting for neurosciences, as it differentiates between peri- and tele-nuclear mitochondria.
However, for an experiment such as the above described, these 13 parameters applied to 225 stacks result in 2,925 individual output files. These require four individual computer inputs, which sum up to over 10,000 manual inputs being required to download all output files. For large experimental designs, this results in a needlessly extremely time-consuming analysis of each file and data integration. Herein we present a routine optimization that allows swift file analysis, greatly reducing document reading and data processing, analyzing data in a defined manner, consistent with the output from existing tools.

Autor im Rampenlicht: Eine optimierte automatisierte Methode zur Untersuchung von Retinsäurerezeptoren in neuronalen Mitochondrien

Optimierte automatisierte Analyse der homöostase-Modulation lebender neuronaler Mitochondrien durch isoformspezifische Retinsäurerezeptoren

My research has focused on the area of neuroscience, and in particular, we want to understand the molecular basis of disease. This has led us to look at cells, their structure, and the organelles that carry out the different cellular functions. Increasingly, mitochondria, they have received more and more attention.Anomalies at the mitochondrial level are becoming absolutely fundamental to understand disease processes, and they may even provide interesting targets for novel drugs or therapeutic strategies. Here at the University of Aveiro, we have been able to develop tools that are of interest to study mitochondria. Not only microscopy and the more traditional approaches, but also we have been able to optimize automated analysis tools coupled with bioinformatic strategies to be able to quantify and provide more detailed analysis when addressing mitochondrial function.The most recent advances include the machine learning algorithms for image segmentation and quantification of mitochondrial parameters. And also the high throughput imaging platforms and deep learning algorithms for improving accuracy and efficiency of mitochondrial characterization. Technologies currently used to advance the field of mitochondrial analysis include high resolution microscopy, live imaging systems, computational analysis tools coupled with machine learning protocols, and CRISPR-Cas9 genome editing for mitochondrial morphology and biology analysis.Current experimental challenges in the field of mitochondria include developing reliable and accurate measurements of mitochondrial parameters, considering the heterogeneity of mitochondrial populations, analyzing the interplay between mitochondrial and cellular biology, and developing non-invasive tools for studying mitochondria in vivo. Our tool enhances efficiency and reliability, allowing for a robust automated analysis of mitochondria. Furthermore, we can explore the potential of hyaluronic acid receptor modulation in personalized medicine for mitochondria.

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Bildanalyse zur Charakterisierung des Mitochondriennetzwerks von ganzen Neuronen

Öffnen Sie zunächst die mitochondrialen Zeitrafferbilder in Bild J2.1.0. Trennen Sie Positionsstapel basierend auf dem Sichtfeld, indem Sie zur Menüleiste navigieren und auf Bild klicken. Gehen Sie dann zu Duplizieren, Slice eingeben oder Frame-Nummer und klicken Sie auf OK. Zeichnen Sie als Nächstes mit dem Werkzeug Freie Auswahl einen Interessenbereich um die Zelle.Um das Makro auszuführen, öffnen Sie Image J, navigieren Sie zur Menüleiste und klicken Sie auf Plugins, Makros und Ausführen. Wählen Sie dann Hintergrund löschen und speichern Sie das MAKRO des Bildes. Um die Pixelgröße und die Voxeltiefe zu bestimmen, öffnen Sie Bild J und wählen Sie Bild.Rufen Sie die Menüleiste auf, wählen Sie Bild und klicken Sie auf Eigenschaften. Nachdem Sie die Pixelgröße und die Voxeltiefe bestimmt haben, zeichnen Sie mit dem Werkzeug "Freie Auswahl" einen Interessenbereich, der die gesamte Zelle umfasst, um die gesamte Zelle in alle 15 Frames einzubeziehen. Navigieren Sie zur Menüleiste, klicken Sie auf Plugins, Makros und wählen Sie Hintergrund löschen und speichern Sie das MAKRO des Bildes.Wählen Sie den gewünschten Speicherordner aus und klicken Sie auf Speichern, um die Datei im TIFF-Format zu speichern. Erstellen Sie dann drei Hauptordner mit den Titeln "Alle Spuren", "Perinukleare Spuren" und "Telenukleare Spuren". Erstellen Sie einen nummerierten Unterordner für jedes Bild, das in jedem Hauptordner verarbeitet werden soll, beginnend mit einem.Fügen Sie jedem Image-Ordner eine Kopie der beiden ergänzenden Dateien für die Routinenoptimierung hinzu. Um die Standardversion der Mattendatei zu identifizieren oder zu ändern, navigieren Sie im Abschnitt Umgebung zur Registerkarte Start und klicken Sie auf Einstellungen. Wählen Sie dann MATLAB aus.Öffnen Sie die MATLAB-Software auf dem Computer, navigieren Sie zur Menüleiste, wählen Sie Apps aus und öffnen Sie Mitometer. Wählen Sie 3D starten und legen Sie die Pixelgröße auf 0,1395089 Mikrometer, die Zeit zwischen den Frames auf 15 Sekunden, die Anzahl der Z-Ebenen auf 8 und den axialen Abstand zwischen den Z-Ebenen auf 0,418809 Mikrometer fest. Wählen Sie die einzugebenden Bilder aus.Gehen Sie nun zum Mitometer-Seitenmenü, wählen Sie Bild und klicken Sie auf Hervorgehoben auswählen. Navigieren Sie zur Mitometer-Menüleiste, wählen Sie Tracks auswählen gefolgt von Track-Ansichten. Wählen Sie dann aus allen Spuren, telenuklearen oder perinuklearen Optionen.Speichern Sie die Ergebnisse in einer Textdatei, indem Sie In txt speichern auswählen, und extrahieren Sie die Ergebnisdateien in die erstellten Ordner. Bereiten Sie die zufällige xlsx-Datei vor, die den Schlüssel für die Bildkodierung enthält. Fügen Sie eine Folge aufeinanderfolgender ganzer Zahlen, beginnend mit eins, in Spalte A ein und füllen Sie Spalte B mit alphanumerischen Zeichen, die die analytischen Variablen bilden.Doppelklicken Sie auf die ausführbare Datei mlx, geben Sie die Anzahl der Ordner ein, klicken Sie auf Verzeichnis des Ordners angeben und wählen Sie Verzeichnis speichern. Wählen Sie den Namen der Tabelle in der Ausgabedatei aus und klicken Sie auf Ausführen. Führen Sie anschließend die erforderliche statistische Analyse durch.Repräsentative Bilder der Mitochondrien nach der Behandlung, entsprechende Oberflächendiagramme und automatisierte Segmentierung werden präsentiert. Eine signifikante Abnahme der durchschnittlichen Mitochondrienlänge wurde in mit AM580 behandelten Zellen beobachtet. Die mitochondriale Oberfläche nahm in Zellen, die mit AM580 und BMS493 behandelt wurden, signifikant ab.Die für das mitochondriale Volumen normalisierte TMRM-Intensität zeigte eine signifikante Abnahme der mit Retinsäure und CH55 behandelten Zellen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Image Analysis for Characterizing Whole-Neuron Mitochondria Network

Optimized Automated Analysis of Live Neuronal Mitochondria Homeostasis Modulation by Isoform-Specific Retinoic Acid Receptors

The complex mitochondrial network makes it very challenging to segment, follow, and analyze live cells. MATLAB tools allow the analysis of mitochondria in ...