Name: Analisi delle immagini per la caratterizzazione della rete di mitocondri dell'intero neurone
Uploaded: 2023-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Image Analysis for Characterizing Whole-Neuron Mitochondria Network at JoVE.com

image analysis for characterizing whole-neuron mitochondria network

Ottimizzazione MATLAB per l'analisi delle reti mitocondriali nelle neuroscienze

Cellular mitochondria sit at the center of all physiological states, and a thorough understanding of their homeostasis (mitostasis) and behavior is paramount to assist in identifying pharmacological treatment for a wide range of illnesses, including cancer and Alzheimer&#39;s disease1,2.
Mitochondria play crucial cellular roles in energy homeostasis, ATP generation, calcium buffering, and ROS regulation, and mitostasis is essential for maintaining protein homeostasis as molecular chaperones are energy-dependent3. These require a constant and dynamic network modulation and adaptation to efficiently meet cellular needs, and mitochondria transport is regulated by different signaling pathways; previous work has described one such pathway, that of retinoic acid receptors (RARs)4,5. Retinoic acid (RA) promotes axonal and neurite outgrowth via RAR activation. In mouse primary cortical neurons, activation of RAR-&#946; encourages mitochondrial growth, speed, and mobility in the neurite6.
Considering the mitochondrial network adaptability and dynamics, the possibility of assessing mitostasis in &#34;real time&#34; is essential not only for investigating energy homeostasis, but also for proteostasis, cellular health, proliferation, or signaling. A commonly used method for evaluating mitostasis relies on confocal microscopy after highlighting mitochondria using a fluorescent dye or marker, as well as a specific microscopy setup allowing temperature and/or CO2 regulation7. This type of experimental setup entails that one experimental replicate be performed at a time. In addition to experimental repetition of different treatments, it should be considered that most experiments should have their technical replicates (where more than one position is imaged per plate), with a series of focal planes (z-stacks) being recorded in a series of time points. Thus, an experimental design with three repetitions of one control and two treatments, with five imaging positions per plate, and 15 time points, results in 225 stacks to be processed. Classically, videos of live mitochondria were analyzed by plotting kymographs, which would be individually analyzed8, in a time-consuming process requiring extensive manual input, even when relying on computer tools.
An algorithm was recently described9 that allows automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell 2-D and 3-D time-lapse files. Other quantification techniques are available, and all have their limitations10. Mitometer, an automated open-source application, is particularly adequate for time lapse and mitochondria dynamics analysis, requiring low user input. This application has a series of advantages over other existing MATLAB-based tools, namely allowing the automatic processing of individual TIF stacks, using up to 13 different parameters, particularly interesting for neurosciences, as it differentiates between peri- and tele-nuclear mitochondria.
However, for an experiment such as the above described, these 13 parameters applied to 225 stacks result in 2,925 individual output files. These require four individual computer inputs, which sum up to over 10,000 manual inputs being required to download all output files. For large experimental designs, this results in a needlessly extremely time-consuming analysis of each file and data integration. Herein we present a routine optimization that allows swift file analysis, greatly reducing document reading and data processing, analyzing data in a defined manner, consistent with the output from existing tools.

Autore in primo piano: Un metodo automatizzato ottimizzato per lo studio dei recettori dell'acido retinoico nei mitocondri neuronali

Analisi automatizzata ottimizzata della modulazione dell'omeostasi dei mitocondri neuronali vivi da parte dei recettori dell'acido retinoico isoform-specifici

My research has focused on the area of neuroscience, and in particular, we want to understand the molecular basis of disease. This has led us to look at cells, their structure, and the organelles that carry out the different cellular functions. Increasingly, mitochondria, they have received more and more attention.Anomalies at the mitochondrial level are becoming absolutely fundamental to understand disease processes, and they may even provide interesting targets for novel drugs or therapeutic strategies. Here at the University of Aveiro, we have been able to develop tools that are of interest to study mitochondria. Not only microscopy and the more traditional approaches, but also we have been able to optimize automated analysis tools coupled with bioinformatic strategies to be able to quantify and provide more detailed analysis when addressing mitochondrial function.The most recent advances include the machine learning algorithms for image segmentation and quantification of mitochondrial parameters. And also the high throughput imaging platforms and deep learning algorithms for improving accuracy and efficiency of mitochondrial characterization. Technologies currently used to advance the field of mitochondrial analysis include high resolution microscopy, live imaging systems, computational analysis tools coupled with machine learning protocols, and CRISPR-Cas9 genome editing for mitochondrial morphology and biology analysis.Current experimental challenges in the field of mitochondria include developing reliable and accurate measurements of mitochondrial parameters, considering the heterogeneity of mitochondrial populations, analyzing the interplay between mitochondrial and cellular biology, and developing non-invasive tools for studying mitochondria in vivo. Our tool enhances efficiency and reliability, allowing for a robust automated analysis of mitochondria. Furthermore, we can explore the potential of hyaluronic acid receptor modulation in personalized medicine for mitochondria.

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Analisi delle immagini per la caratterizzazione della rete di mitocondri dell'intero neurone

Iniziare aprendo le immagini mitocondriali time-lapse nell'immagine J2.1.0. Separa le pile di posizioni in base al campo visivo navigando nella barra dei menu e facendo clic su Immagine. Quindi, vai a Duplica, Immetti sezione o Numero fotogramma e fai clic su OK. Quindi, disegna un'area di interesse intorno alla cella utilizzando lo strumento Selezione libera.Per eseguire la macro, apri Image J, vai alla barra dei menu e fai clic su Plugin, Macro ed Esegui. Quindi, seleziona Cancella lo sfondo e salva la MACRO dell'immagine. Per determinare la dimensione dei pixel e la profondità del voxel, apri Immagine J e seleziona Immagine.Accedere alla barra dei menu, selezionare Immagine e fare clic su Proprietà. Dopo aver determinato la dimensione dei pixel e la profondità del voxel, disegna una regione di interesse che comprenda l'intera cella utilizzando lo strumento Selezione libera per includere l'intera cella in tutti i 15 fotogrammi. Vai alla barra dei menu, fai clic su Plugin, Macro e seleziona Cancella lo sfondo e salva la MACRO dell'immagine.Scegliere la cartella di salvataggio desiderata e fare clic su Salva per memorizzare il file in formato TIFF. Quindi, creare tre cartelle principali denominate Tutte le tracce, Tracce perinucleari e Tracce telenucleari. Crea una sottocartella numerata per ogni immagine da elaborare all'interno di ogni cartella principale, a partire da una.Aggiungere una copia dei due file supplementari di ottimizzazione di routine in ogni cartella di immagini. Per identificare o modificare la versione predefinita del file mat, passare alla scheda Home nella sezione Ambiente e fare clic su Preferenze. Quindi, seleziona MATLAB.Apri il software MATLAB sul computer, vai alla barra dei menu, seleziona le app e apri Mitometer. Selezionare Avvia 3D e impostare la dimensione dei pixel su 0,1395089 micrometri, il tempo tra i fotogrammi su 15 secondi, il numero di piani z su 8 e la distanza assiale tra i piani z su 0,418809 micrometri. Selezionare le immagini da inserire.Ora vai al menu laterale Mitometro, seleziona Immagine e fai clic su Seleziona evidenziato. Passare alla barra dei menu Mitometro, scegliere Seleziona tracce seguito da Visualizzazioni tracce. Quindi, scegli tra Tutte le tracce, Opzioni telenucleari o Perinucleari.Salvare i risultati in un file di testo selezionando Salva in txt ed estrarre i file dei risultati nelle cartelle create. Preparare il file xlsx di randomizzazione, che contiene la chiave per la codifica delle immagini. Inserire una sequenza di numeri interi consecutivi, a partire da uno, nella colonna A, popolare la colonna B con caratteri alfanumerici, che costituiscono le variabili analitiche.Fare doppio clic sull'eseguibile mlx, immettere il numero di cartelle, fare clic su Specificare la directory della cartella e selezionare Salva directory. Seleziona il nome del foglio di calcolo nel file di output e fai clic su Esegui. Successivamente, eseguire l'analisi statistica necessaria.Vengono presentate immagini rappresentative dei mitocondri dopo il trattamento, i rispettivi grafici di superficie e la segmentazione automatica. Una significativa diminuzione della lunghezza media mitocondriale è stata osservata nelle cellule trattate con AM580. La superficie mitocondriale è diminuita significativamente nelle cellule trattate con AM580 e BMS493.L'intensità del TMRM normalizzata per il volume mitocondriale ha mostrato una diminuzione significativa nelle cellule trattate con acido retinoico e CH55.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Image Analysis for Characterizing Whole-Neuron Mitochondria Network

Optimized Automated Analysis of Live Neuronal Mitochondria Homeostasis Modulation by Isoform-Specific Retinoic Acid Receptors

The complex mitochondrial network makes it very challenging to segment, follow, and analyze live cells. MATLAB tools allow the analysis of mitochondria in ...