dna extraction from fermented grape for metagenomic analysis

Profilering van de bacteriële gemeenschap in druiven met behulp van Amplicon Metagenomics

Traminette grape is characterized by production of superior wine quality, in addition to appreciable yield and partial resistance to several fungal infections1,2,3. The natural fermentation of grapes relies on associated microorganisms, wine production environment, and fermentation vessels4,5. Oftentimes, many wineries rely on wild yeast and bacteria for fermentation, production of alcohol, esters, aroma, and flavor development6.
The goal of this study is to examine the bacterial composition of grapes and monitor their dynamics during fermentation. Although, the modern use of starter cultures such as Saccharomyces cerevisiae for primary fermentation, where alcohol is produced, is common to different wine styles7. In addition, secondary fermentation, where malic acid is decarboxylated by Oenococcus oeni to lactic acid, improves the organoleptic and taste profile of the wine and reduces the acidity of wine8,9. With the recent advances in the use of culture-independent methods, it is now possible to determine different microbes associated with the wine grape and the species that are transferred to must and participate in the fermentation at different times up to the final product10.
The roles and dynamics of wild bacteria from different grapes transferred to the must during wine fermentation are poorly understood. The taxonomy of many of these bacteria is not even known, or their phenotypic properties are uncharacterized. This makes their application in coculture fermentation still poorly underutilized. However, microbiological culture-based analysis has been used to determine the bacterial population associated with grapes and wine10. It is widely known that selective culture plating is tedious, prone to contamination, has a low reproducibility, and output can be doubtful; it also misses bacterial species whose growth requirements are unknown. Previous studies indicate that culture-independent, 16S rRNA gene-based methodologies offer a more dependable and cost-effective approach to characterizing complex microbial communities11. For example, sequencing the hypervariable regions of the 16S rRNA gene has been successfully employed to study bacteria in grapes leaves, berries, and wine12,13,14. Studies have shown that the use of either 16S rRNA metabarcoding or whole metagenomic sequencing is suitable for microbiome studies15. There is emerging information about the possible linkage of bacterial diversity to their metabolic attributes during wine production, which could help in the determination of oenological properties and terroir16.
The need to maximize the advantages of the metagenomic tools using next-generation sequencing (NGS) to study the grape and wine microbial ecology has been emphasized16,17. Also, the use of culture-independent methods based on high throughput sequencing to profile microbial diversity of the food and fermentation ecosystem has become very relevant and valuable to many laboratories and is recommended for industrial use18,19. It provides an advantage of detection and taxonomic profiling of the present microbial populations and the contribution of environmental microbes, their relative abundance, and alpha and beta diversity20. The sequencing of the variable region of the 16S region has become an important gene of choice and has been used during different microbial ecological studies.
While many studies focus on fungi, especially yeast, during wine fermentation21, this study reported the 16S amplicon sequencing and bioinformatic tools used to study the bacteria during Traminette grapes fermentation for wine production.

Auteur in de schijnwerpers: onderzoek naar het fermentatiemicrobioom door middel van sequencing van de volgende generatie

Profilering van de bacteriële gemeenschap van fermenterende Traminette-druiven tijdens de wijnproductie met behulp van metagenomische amplicon-sequencing

Research scope focuses on the understanding of the fermentation microbiome. This is to answer questions such as how diverse microbes in natural fermentation are, and what gene coding for metabolite is necessary for flavor and safety. One of the latest advancement in our field involves understanding how the dynamics of the microbiome correlate with the metabolic profile observed in fermented foods and beverages.The next generation sequence stands out as a pivotal technology that is currently driving advancements in our research field

DNA-extractie uit gefermenteerde druif voor metagenomische analyse

Breng om te beginnen 20 milliliter van het gefermenteerde druivenmonster over in een steriele buis van 50 milliliter met schroefdop. Voeg vervolgens 10 milliliter koud water toe aan de buis en vortex voor homogenisatie. Centrifugeer het monster gedurende één minuut bij 800 G bij vier graden Celsius.Breng het supernatans over in een nieuwe buis van 50 milliliter en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 3000 G bij vier graden Celsius. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspendeert u de pellet in één milliliter PBS. Breng de celsuspensie over in een schroefdopbuis van twee milliliter en centrifugeer gedurende twee minuten bij 14.000 G.Resuspendeer de pellet nu in 978 microliter natriumfosfaatbuffer met een pH van 7,4 en 122 microliter DNA-buffer. Draai de buis en plaats deze gedurende 45 minuten tot een uur op vier graden Celsius. Breng een milliliter van het monster over in een lysisoplossing in één buis en draai de dop vast.Homogeniseer het monster drie keer in een kralenmolen gedurende 60 seconden elk. Centrifugeer vervolgens de lyserende matrix E-buis gedurende één minuut bij 16.800 G.Breng het supernannt over in een schone microbuis en voeg 250 microliter eiwitneerslagoplossing toe aan de buis. Schud de tube 10 keer om de inhoud te mengen.Centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij 16.800 g en breng het supernatans over in een steriele buis van 15 milliliter. Voeg vervolgens een milliliter bindingsmatrixsuspensie toe aan het supernatans en meng door de buizen twee minuten om te keren voordat u ze drie minuten in een rek plaatst. Nadat u een milliliter van de supernatant hebt verwijderd, resuspendeert u de matrix in de resterende supernatant.Breng 600 microliter van het mengsel over in een centrifugefilterbuis en centrifugeer. Decanteer vervolgens de doorstroming en voeg 500 microliter wasoplossing toe aan de centrifugefilterbuis. Verwijder het centrifugefilter en plaats het gedurende vijf minuten in een verse opvangbuis.Voeg na het drogen 50 microliter warm DNAse-vrij water toe aan het filtermembraan en roer de matrix voorzichtig met een pipetpunt. Centrifugeer gedurende één minuut bij 14.500 G om het DNA te elueren. Laad het monster op een agarosegel.Meet ten slotte de DNA-concentratie.

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Extraction from Fermented Grape for Metagenomic Analysis

Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing

Advances in sequencing technology and the relatively easy access to the use of bioinformatics tools to profile microbial community structures have ...

High-Throughput Sequencing and Bioinformatic Analysis in Grape Must and Wine for Microbial Diversity

High-throughput sequencing en bio-informatica analyse in druivenmost en wijn voor microbiële diversiteit