Iniziare mantenendo le cellule TMPRSS2 HEK-293T ACE2 in DMEM contenenti FBS attivato riscaldato, penicillina e streptomicina in un pallone T75. Per il conteggio delle cellule, mescolare 20 microlitri di sospensione cellulare con 20 microlitri di soluzione Trypan Blue. Aggiungere 20 microlitri di sospensione cellulare mista colorante alla camera di conteggio delle cellule e contare il numero di cellule per millilitro.
Seminare 2,5 volte 10 alla potenza di quattro cellule HEK-293T ACE2 TMPRSS2 in 50 microlitri di terreno DMEM completo in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Incubare le cellule in un'incubatrice ad anidride carbonica per una notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, sostituire i 50 microlitri di DMEM con 50 microlitri di sospensione virale e incubare per 18 ore a 37 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, aggiungere 7,5 microlitri di tampone di lisi cellulare a ciascun pozzetto e mescolare su un agitatore orbitale per due minuti. Una volta lisate le cellule, aggiungere la soluzione del saggio della luciferasi della lucciola appena preparata e mescolarle su un agitatore orbitale per un minuto. Analizzare l'attività della luciferasi utilizzando un lettore di micropiastre per luciferasi commerciale.
Per il test degli anticorpi neutralizzanti, seminare le cellule HEK-293T in 50 microlitri di DMEM completo come dimostrato in precedenza. In una piastra a 96 pozzetti, aggiungere otto microlitri di anticorpo neutralizzante 27 BV ed eseguire diluizioni seriali con sei microlitri di DMEM senza siero. Aggiungere 54 microlitri di particella virale Ha-CoV-2 all'anticorpo diluito in serie e mescolare la sospensione.
Incubare per un'ora a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Quindi aggiungere 50 microlitri di sospensione virale ai pozzetti contenenti cellule HEK-293T. Per i controlli, aggiungere 50 microlitri di terreno DMEM completo nei pozzetti contenenti solo cellule HEK-293T.
Mettere la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 18 ore. Dopo aver lisizzato le cellule come dimostrato in precedenza, aggiungere la soluzione del saggio della luciferasi della lucciola appena preparata e mescolare agitando orbitalmente per un minuto. Analizzare l'attività della luciferasi utilizzando un lettore di micropiastre per luciferasi commerciale.
Ha-CoV-2 Omicron e le varianti Omicron hanno generato un segnale da quattro a dieci volte superiore rispetto all'Ha-CoV-2 Wild-type, suggerendo una maggiore infettività. L'anticorpo 27 BV ha dimostrato attività neutralizzante contro le varianti Delta e Omicron. L'ID50 di 27 BV per Omicron era circa 10 volte meno potente dell'ID50 per Wild-type e Delta.
