Per iniziare, metti i semi di Brassica napus DH12075 in microtubi. Per sgrassare i semi, aggiungere acqua e detersivo allo 0,1% nel microtubo e agitare per 60 secondi. Ora sciacquare i semi con acqua seguita da etanolo al 70%, ciascuno per 60 secondi.
Successivamente, mettere i semi in una soluzione di ipoclorito di sodio al 10% e agitare per 20 minuti. Dopo aver rimosso la candeggina, lavare i semi quattro volte con acqua sterile per 60 secondi ciascuno. Metti i semi su una capsula di Petri contenente il terreno di germinazione dei semi.
Stratificare a freddo i semi a quattro gradi Celsius durante la notte prima di spostare il piatto in una stanza di coltivazione. Dopo cinque giorni, trasferisci le piantine in una scatola di coltura contenente un terreno di coltura per piante. Inoculare l'agrobatterio Ti tumefaciens C58C1 che trasporta un plasmide peloso che induce le radici PRIA 4B in cinque millilitri di terreno LB.
Coltiva la coltura durante la notte a 28 gradi Celsius fino a raggiungere una densità ottica di 600 nanometri di 0,9 a uno. Trasferire l'inoculo batterico nella siringa. Utilizzando un ago calibro 26 montato sulla siringa, perforare l'ipocotile di una piantina di 18 giorni a circa un centimetro sopra il terreno di coltura.
Iniettare circa 50 microlitri di inoculo nella ferita e grattare il tessuto sulla superficie dell'ipocotile. Rimetti la pianta nella stanza di coltivazione a 21 gradi Celsius per due o quattro settimane. Successivamente, taglia il callo con le radici pelose emerse dall'ipocotile.
Posizionare il callo con le radici pelose su una capsula di Petri contenente terreno di coltura per radici pelose e antibiotici per sopprimere la crescita agrobatterica. Sigillare la capsula con nastro adesivo permeabile ai gas prima di incubarla a 24 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, isolare le radici pelose dal callo e trasferire le singole radici in un terreno di coltura a radice pelosa.
In alternativa, per generare una pianta composita costituita da germogli selvatici e radici pelose transgeniche, rimuovere le radici native della pianta. Quindi trasferisci la pianta con le radici pelose emergenti in una scatola di coltura contenente terreno di coltura e antibiotici per sopprimere la crescita agrobatterica.
