Para comenzar, inicie el software del sistema de análisis de células vivas. Presione el símbolo más en la esquina superior izquierda de la pantalla para iniciar la adición de recipientes. Elija Escanear según programación y, a continuación, seleccione Nuevo para ejecutar el programa de escaneo.
Seleccione Estándar. A continuación, establezca los ajustes de escaneo como opciones celda por celda en Ninguno y los canales de imagen en Fase, Verde y Rojo, con los respectivos tiempos de adquisición. Establezca el objetivo en 20x.
De la lista, elija la placa y seleccione la ubicación del recipiente para colocar la placa en la bandeja del sistema de imágenes. Seleccione los pocillos que contienen muestras y decida el número de imágenes que desea capturar por pocillo. Esta información genera automáticamente una duración estimada del escaneo de la placa.
Haga clic en Crear mapa de placas para introducir información para cada pozo, como el tipo de celda y el compuesto. A continuación, asigne un nombre al estudio. En la siguiente pantalla, seleccione Analizador básico como tipo de análisis y elija Definición de análisis en la lista desplegable, que muestra las definiciones de análisis utilizadas anteriormente.
Deje la desmezcla espectral tanto para el verde como para el rojo en 0,0. Programe el escaneo para que se realice cada 15 a 20 minutos durante ocho horas. Arrastre la barra blanca y gris en la parte superior de la pantalla para establecer la hora de inicio del escaneo.
En la siguiente pantalla, revise la configuración de escaneo y presione Agregar a la programación para comenzar a escanear. Después de escanear, en la pestaña Ver, abra el recipiente para el análisis. Presione Iniciar análisis a la izquierda de la pantalla y seleccione Crear nueva definición de análisis.
Elija Analizador básico y utilice los canales de imagen Fase, Verde, Rojo y Superposición. Seleccione de seis a ocho imágenes de muestra representativas para el entrenamiento. Para configurar la definición del análisis, establezca los objetos verdes en los neutrófilos que forman trampas extracelulares de neutrófilos o NET, y los objetos rojos en los núcleos de todos los neutrófilos.
Presione Vista previa actual o Vista previa de todo y ajuste cada parámetro para optimizar los resultados. Elija los tiempos de escaneo y los pozos para el análisis. A continuación, proporcione una etiqueta para la definición del análisis.
Revise el resumen e inicie el análisis. Después del análisis, haga doble clic en el nombre de la definición de análisis para abrir el estudio analizado. Abra Capas a la izquierda de la pantalla y verifique si cada celda está marcada correctamente.
Haga clic en Métricas de gráficos a la izquierda de la pantalla y, a continuación, seleccione recuento por imagen para el recuento verde. Elija los puntos de tiempo y los pozos que se van a exportar. Para seleccionar la agrupación, seleccione Réplicas de mapa de placas para confirmar que todos los pozos se especifican correctamente durante el escaneo y haga clic en Exportar datos.
Del mismo modo, exporte los datos para el recuento de rojos y el recuento de superposición. Usando la ecuación dada, calcule el porcentaje de NETs que forman celdas para cada condición y punto de tiempo. El curso temporal de la formación de NET se visualiza trazando el porcentaje de neutrófilos formadores de NET en cada punto de tiempo.
La adición de un inhibidor de AKT bloqueó la formación de NET en neutrófilos estimulados con PMA o ionóforo de calcio. La demostración de las moléculas potenciales dirigidas a la formación de NET puede probarse de una manera de alto rendimiento utilizando esta metodología.
