Cepas de Shigella de tres vetas en placas de agar que contienen colorante rojo Congo para garantizar que las colonias sean virulentas y para evitar el uso de colonias no virulentas en los ensayos de infección. Para empezar, toma los cultivos de Shigella cultivados durante la noche y vórdelos. Agregue 100 microlitros del cultivo a cinco mililitros de TSB fresca en un tubo de cultivo.
Incubar los cultivos a 37 grados centígrados mientras se agitan a 250 RPM hasta alcanzar una densidad óptica de 0,7 a 600 nanómetros. Transfiera 2 veces 10 a las 8 unidades formadoras de colonias de Shigella subcultivada a tubos de microcentrífuga de 2 mililitros. Células de pellets por centrifugación a 17.000 g durante dos minutos a temperatura ambiente.
Aspirar el sobrenadante. Agregue un mililitro de PBS tibio y vuelva a suspender bien el gránulo. Después de centrifugar la célula una vez más, vuelva a suspender el gránulo en dos mililitros de DMEM tibio y haga un vórtice de la suspensión celular.
A continuación, añada un mililitro de Shigella resuspendida y un mililitro de DMEM a cada pocillo de monocapas epiteliales colónicas HT29 en seis placas de pocillos. Para asegurar el contacto bacteriano con las células HT29, centrifugue las seis placas de pocillos a 2.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente o 37 grados Celsius. Incubar seis placas de pocillos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 45 minutos.
Para determinar el título de infección bacteriana, prepare diluciones seriadas diez veces mayores de células Shigella resuspendidas en PBS. Coloque 100 microlitros de las diluciones 1 por 10 a 5 y 1 por 10 a las 6 en placas de rojo Congo con TSB, e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Después de la incubación, aspire los medios de cada pocillo.
Agregue un mililitro de PBS tibio a cada pocillo y lave suavemente. Luego agregue dos mililitros de DMEM tibio con 50 microgramos por mililitro de gentamicina e incube durante 30 minutos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Lave las células HT29 infectadas tres veces con un mililitro de PBS.
Agregue dos mililitros de DMEM tibio con gentamicina a cada pocillo e incube hasta por 24 horas para la replicación intracelular a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Al final de la incubación, lavar las células dos veces con un mililitro de PBS. Agregue un mililitro de PBS con 1% Triton X-100 a cada pocillo para lisar las células HT29.
Luego, con un raspador celular o una punta de pipeta doblada, raspe las células lisadas del fondo del pocillo y transfiera la mezcla a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros. Agite cada tubo durante al menos 30 segundos para desplazar aún más a Shigella de las células eucariotas lisadas. Prepare diluciones seriadas diez veces mayores de los lisados y PBS.
Coloque 100 microlitros de las diluciones en serie en placas de rojo Congo con TSB e incube durante la noche a 37 grados centígrados.
