creating the navigation map for clem and preparation of the ultrathin sections for electron microscopy

Nytt protokoll för samtidig fluorescens och bevarande av ultrastruktur

Fluorescence microscopy (FM) can be used to obtain the localization and distribution of the target protein. However, the context that surrounds the target protein is lost, which is crucial for investigating the target protein thoroughly. Electron microscopy (EM) has the highest imaging resolution, providing several subcellular details. Nevertheless, EM lacks target labeling. By accurately merging the fluorescence image taken by FM with the gray image acquired by EM, correlative light and electron microscopy (CLEM) can combine the information obtained by these two imaging modes1,2,3,4.
CLEM is a trade-off between fluorescence and the ultrastructure1. Because of the limitations of current fluorescent proteins and the traditional EM sample preparation procedures, especially the use of osmic acid (OsO4) and hydrophobic resins such as Epon, the ultrastructure always compromises fluorescence5. OsO4 is an indispensable reagent in EM sample preparation, which is used to improve the contrast of EM images. Compared with other embedding resins, Epon is superior in ultrastructure preservation and sectioning properties5. However, no fluorescent proteins can retain the fluorescence signal after the treatment of OsO4 and Epon embedding6. To overcome the limitations of fluorescent proteins, pre embedding CLEM was developed, in which FM imaging is done before EM sample preparation6. However, the drawback of pre embedding CLEM is the imprecise registration between the FM and the EM images5.
On the contrary, post embedding CLEM method performs the FM imaging after the EM sample preparation, the registration accuracy of which can reach 6-7 nm5,6. To retain the fluorescence of fluorescent proteins, very low concentrations of OsO4 (0.001%)3 or the high-pressure frozen (HPF) and freeze substitution (FS) EM preparation methods4,7 have been used at the expense of compromised ultrastructure or the contrast of the EM image. The development of mEos4b greatly promotes the progress of post embedding CLEM, although glycidyl methacrylate is used as the embedding resin5. With the development of mEosEM, which can survive the OsO4 staining and Epon embedding, Epon post embedding super-resolution CLEM was achieved for the first time, maintaining the fluorescence and ultrastructure simultaneously6. After mEosEM, several fluorescent proteins that can survive the OsO4 staining and the Epon embedding were developed8,9,10,11. This greatly promotes the development of CLEM.
There are three key aspects to Epon post-embedding CLEM. The first is the fluorescent protein, which should maintain the fluorescent signal after EM sample preparation. According to our experience, mScarlet is superior to other reported fluorescent proteins. The second is how to find the same cell imaged by FM imaging in EM imaging. To solve this problem, we improve the procedure for this step so that one can readily find the targeted cell. The last is the method to align the FM image with the EM image. Here, we detail the registration between the FM and the EM images. In this protocol, we express mScarlet in VGLUT2 neurons and demonstrate that mScarlet can target secondary lysosomes using Epon post-embedding CLEM. We provide step-by-step details for Epon post-embedding CLEM, without compromising the fluorescence and the ultrastructure.

Författare i fokus: Framsteg inom korrelativ ljus- och elektronmikroskopi med fluorescerande proteinkonservering

Epon Post Embedding Korrelativ Ljus och Elektronmikroskopi

Correlative light and electron microscopy is a completely stable microscopy technique, which can combine the localization information provided by fluorescent microscopy and is the ultra structure by electron microscopy. However, the mentality of this technique is to preserve the fluorescence of after you have a simple preparation. Using this fluorescent protein, we can achieve correlative light and the electron microscope which can maintain fluorescence and ultra structure simultaneously.

Skapa navigationskartan för CLEM och förberedelse av de ultratunna sektionerna för elektronmikroskopi 

Börja med att ta en ultratunn del av musens hjärnvävnad som uttrycker mScarlet. Tillsätt 10 mikroliter monteringsbuffert på den ultratunna delen på täckglaset och placera ett nytt rent täckglas på monteringsbufferten. Sätt in de två täckglasen med den ultratunna sektionen i en bildkammare.Lokalisera sektionen med hjälp av ringmarkören i ljusfältsavbildningsläget för ett inverterat fluorescensmikroskop och flytta till ett hörn av sektionen. Slå på det vita ljuset och ta den ljusa fältbilden. Stäng sedan av det vita ljuset.Aktivera lasern och ta fluorescerande bilder av samma synfält. Avaktivera lasern och flytta till det intilliggande synfältet med 10 % överlappning. Ta både det ljusa fältet och den fluorescerande bilden av det andra synfältet och spela in bildvägen för att sy ihop synfältet.Använd nu navigeringskartan för att rikta in dig på celler av intresse. Aktivera lasern och ta 300 bilder av fluorescerande bilder av den aktuella cellen. Avaktivera sedan lasern.Aktivera sedan det vita ljuset och ta cirka 100 sekventiella ljusfältsbilder. För att förbereda sektionerna för elektronmikroskopi, fyll en glasburk med dubbeldestillerat vatten. Ta bort skyddsglasen som håller de ultratunna sektionerna från bildkammaren och separera dem med en pincett.Kläm fast täckglaset med sektionen. Tvätta av monteringsbufferten med dubbelt destillerat vatten och låt den torka. Använd ett enkelsidigt blad för att göra en hash runt den ultratunna sektionen.Släpp 10 mikroliter 12 % fluorvätesyra i varje hörn av skåran. Placera långsamt täckglaset i vattnet. Flyt sedan Pioloform-filmen och den ultratunna sektionen på vattenytan.Placera ett obestruket slitsgaller på sektionen för att fånga det i rutnätets mitt. Täck en glasskiva med paraform. Ta upp gallret med Pioloform-filmen och låt det lufttorka i rumstemperatur.

Research

JoVE Journal

Biology

Creating the Navigation Map for CLEM and Preparation of the Ultrathin Sections for Electron Microscopy

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence ...

Ultrathin Sectioning for Epon Post-Embedding Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM)

Ultratunn sektionering för epon efter inbäddning av korrelativ ljus- och elektronmikroskopi (CLEM)

Image Analysis of Brightfield and Fluorescence Images of the Mouse Brain Sections for Epon Post-Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Bildanalys av ljusfälts- och fluorescensbilder av mushjärnsnitt för epon efter inbäddning av korrelativ ljus- och elektronmikroskopi

Registration of the Fluorescence Microscopy Image with the Electron Microscopy Image for Correlative Light and Electron Microscopy

Registrering av fluorescensmikroskopibilden med elektronmikroskopibilden för korrelativ ljus- och elektronmikroskopi