진동 놀람 분석을 사용한 제브라피시 배아의 화학물질의 치사율 및 신경근 독성 평가

먼저 제브라피시 배아를 채취하여 섭씨 28.5도의 인큐베이터에서 수정 후 72시간까지 키웁니다. 동시에 원하는 농도로 테스트할 화학 물질을 준비합니다. 수정 후 72시간 배아를 검사합니다.

죽거나 부화하지 않은 배아를 제거합니다. 각 6cm 조직 배양 접시에 10개의 배아를 9ml의 E3 배지와 함께 넣습니다. 이를 노출판이라고 합니다.

각 노출판에 화합물 이름 노출 농도를 표시하고 번호를 반복합니다. 가장 낮은 농도부터 시작하여 각 플레이트에 1밀리리터의 노출 용액을 추가하고 플레이트를 부드럽게 휘젓습니다. 용해도가 낮은 화합물의 경우 10 밀리리터의 매체 전체를 노출 용액으로 대체하십시오.

화합물 용액이 배아에 첨가된 순서를 기록한 다음 섭씨 28.5도의 인큐베이터 내 가습 챔버에서 48시간 동안 플레이트를 배양합니다. 진동 깜짝 분석을 시작하려면 컴퓨터와 진동 장치를 켜십시오. 구성 파일에 대한 스프레드시트를 만듭니다.

5개의 플레이트 위치 각각에 대한 노출 정보를 포함하고 화합물, 농도 및 반복을 지정합니다. 진동 깜짝 분석 키트에 대한 일반 사용자 인터페이스 또는 GUI 프로그램을 엽니다. GUI 프로그램에서 다른 위치를 선택하여 카메라 움직임을 확인하고 카메라의 응답을 관찰합니다.

인큐베이터에서 샘플 플레이트를 제거합니다. 지정된 5개의 위치에 놓고 배아를 몇 분 동안 가라앉히십시오. GUI 프로그램에서 녹화를 클릭하면 새 창이 나타납니다.

이 창에서 이전에 준비한 구성 파일을 선택합니다. 샘플 설명이 각 위치의 샘플과 일치하는지 확인합니다. 프로그램에 의해 사운드 펄스가 활성화될 때 LED가 켜지는 것을 관찰하십시오.

녹화 후 카메라가 위치 1로 돌아가고 소프트웨어가 파일 압축을 시작합니다. 측정된 샘플을 다음 세트로 교체하고 설명된 대로 다음 실행을 진행합니다. 그런 다음 배아를 동시에 유지하기 위해 체를 사용하여 측정된 모든 플레이트에서 노출 용액을 수집합니다.

데이터 분석을 시작하려면 가상 더빙 또는 다른 시청 소프트웨어로 비디오 데이터를 엽니다. 소리 펄스에 반응하는 배아의 수를 시각적으로 채점합니다. 화합물 이름, 반복실험, 화합물의 농도 및 운동성 배아의 백분율을 스프레드시트에 기록합니다.

R 스크립트가 포함된 KNIME 워크플로를 사용하여 벤치마크 농도 분석을 수행합니다. 치료되지 않은 야생형 배아의 운동성 평가는 진동 자극을 받았을 때 평균 14.33%의 운동성을 보였으며 클러치에 따라 차이가 있었습니다. 운동성에 대한 트리카인 효과에 대한 벤치마크 농도 계산은 1% 농도에서 운동성의 감소를 보여주었으며, 벤치마크 농도 50 164.9마이크로몰에서 2.5% 이상의 활성을 중단했습니다.

차선의 분석 예는 배아 반응의 불일치를 보여주었으며, 이는 놀람 반응의 견고성에 영향을 미치는 발달 문제를 암시합니다.