Name: Live Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers
Uploaded: 2024-01-19T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers at JoVE.com

live imaging of virus-infected human intestinal organoid monolayers

Imaging del calcio di monostrati di organoidi intestinali umani infetti da virus

Calcium is a widely conserved second messenger that plays a critical role in regulating cellular physiology1. Given its strong charge, small size, and high solubility in physiological conditions, calcium is an ideal manipulator of protein conformation. This makes calcium a powerful means to transduce electrochemical signals into enzymatic, transcriptional, or post-transcriptional alterations. The strict calcium concentration gradients across the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes create a high driving force that allows for rapid changes in cytosolic calcium concentration. Multiple mechanisms, including both buffering and active transport, tightly maintain this gradient. While necessary for normal cellular functions, this maintenance is energetically expensive, making it particularly susceptible in states of stress 2.
As such, dysregulation of calcium within the cytosol is a near-universal signal of many kinds of cellular stress. Metabolic disturbances, toxins, pathogens, mechanical damage, and genetic perturbations can all disrupt calcium signaling. Regardless of the stimulus, on a whole-cell level, sustained, uncontrolled rises in cytosolic calcium can promote apoptosis and&#160;eventually necrosis3,4. Alterations in cytosolic calcium levels of lower amplitude or higher frequency, however, have varying effects2. Likewise, the outcomes of calcium fluctuations may differ based on the spatial microdomain in which they occur5. Monitoring calcium levels can&#160;therefore offer insight into dynamic signaling processes, but this requires sampling with relatively high temporal and spatial resolution.
Genetically encoded calcium indicators (GECIs) are powerful tools for continuous sampling in live-cell systems6. Some of the most widely used GECIs are GFP-based calcium-responsive fluorescent proteins known as GCaMPs7. The canonical GCaMP is a fusion of three distinct protein domains: a circularly permuted GFP (cpGFP), calmodulin, and M136. The calmodulin domain undergoes a conformation change upon binding calcium, allowing its interaction with M13. The calmodulin-M13 interaction induces a conformational change in the cpGFP that increases its fluorescent emission upon excitation. As such, an increase in calcium concentration correlates with an increase in GCaMP fluorescence intensity. These sensors can be cytosolic or targeted to specific organelles8.
Similar to most tissues, calcium regulates a variety of functions within the gastrointestinal epithelium. The intestinal epithelium is integral for nutrient and fluid absorption but also must form a tight barrier and immune interface to avoid pathogen invasion or toxic insults. Calcium-dependent pathways influence nearly all of these vital functions9,10,11. However, calcium signaling within the intestinal epithelium remains an underexplored frontier with promising potential as a therapeutic target. While monitoring calcium dynamics within the intestinal epithelium in vivo continues to present challenges, human intestinal organoids (HIOs) offer an adaptable ex vivo system for experimentation12. HIOs are 3-dimensional (3D) spheroids derived from human intestinal stem cells and, upon differentiation, recapitulate much of the cellular diversity of the native intestinal epithelium12.
This protocol describes comprehensive methods to engineer HIOs that express GECIs and then prepare engineered HIOs as monolayers for live-cell calcium imaging. It offers viral infection as an example of a pathologic manipulation that disrupts calcium signaling and provides an analytic approach to quantify these changes.

Autore in primo piano: Indagine sull'interruzione virale della segnalazione epiteliale intestinale - Approfondimenti di ricerca e direzioni future 

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Through our work, we aim to understand how viruses disrupt signaling within the intestinal epithelium. We are particularly interested in understanding the ways in which virus-infected cells dysregulate neighboring uninfected cells to contribute to pathogenesis. We've recently discovered that rotavirus-infected cells release pulses of ADP, which dysregulates neighboring uninfected cells and facilitates viral spread and exacerbates disease.While calcium imaging is very popular in fields like neuroscience, it has not been widely used to study epithelial biology or virology. This protocol offers an approach to adapt existing technologies and model systems to study calcium signaling and live virus-infected epithelial tissue. By engineering organoids to express genetically encoded calcium indicators, our approach allows for a consistent, reproducible long-term imaging in a model system that recapitulates the cellular diversity of the human intestinal epithelium.We aim to understand the effects of virus-induced paracrine purinergic signaling for both the host and the virus. Our future work will also determine whether this type of signaling is broadly conserved across other viruses and whether the effects are similar.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers at JoVE.com

Live Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers  

Imaging dal vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus

Per iniziare, impostare il microscopio a epifluorescenza. Prima dell'imaging, preriscaldare l'incubatore Stage Top a 37 gradi Celsius e far scorrere l'anidride carbonica umidificata nella camera a 0,02 litri al minuto. Quindi posizionare il vetrino con i monostrati infetti nella camera dell'incubatrice e sigillare il coperchio.Utilizzando l'obiettivo 20X in condizioni di illuminazione in campo chiaro, selezionare le coordinate X e Y dei campi visivi all'interno del monostrato. Ottimizza i parametri di imaging e acquisisci un'immagine utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri. Per ridurre al minimo la fototossicità, impostare la sorgente luminosa al 50% di potenza con un tempo di esposizione di 50 millisecondi.Assicurarsi che nessun pixel sia saturo e regolare per rilevare l'intera gamma dinamica del sensore di calcio fluorescente. Impostare un ciclo di imaging e acquisire un'immagine a ogni coordinata X e Y selezionata in un ciclo di un minuto e un'immagine in questo ciclo in modo continuo. Per i virus marcati con fluorescenza, acquisire un'immagine sul canale appropriato ogni 10 cicli.Se si utilizzano virus non fluorescenti, eseguire la colorazione amminofluorescente dopo l'imaging. Per prima cosa, fissare i monostrati con 100 microlitri di formaldeide. Dopo l'incubazione, rimuovere il fissativo e spegnere con 100 microlitri di cloruro di ammonio 50 millimolari per 10 minuti.Dopo aver rimosso il cloruro di ammonio, permeabilizzare i monostrati con 100 microlitri di Triton X-100 allo 0,1% per un'ora a temperatura ambiente. Quindi rimuovere la soluzione, aggiungere 100 microlitri di soluzione bloccante e incubare per un'ora. Quindi rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere 100 microlitri di anticorpi primari illusi in PBS 1X.Incubare per una notte a quattro gradi Celsius con un leggero dondolio. Dopo l'incubazione, rimuovere gli anticorpi primari e lavare tre volte con PBS 1X. Infine, aggiungere 100 microlitri di anticorpi secondari coniugati fluorescenti illusi in PBS 1X.Per prevenire il fotosbiancamento, proteggere la piastra dalla luce e incubare per due ore a temperatura ambiente. Rimuovere gli anticorpi secondari dopo l'incubazione e colorare i campioni con la soluzione DAPI. Quindi posizionare i monostrati fissi in 100 microlitri di PBS 1X per l'imaging.Riposizionare il vetrino sul tavolino del microscopio. Ricaricare le coordinate X e Y dall'esecuzione dell'imaging in tempo reale e visualizzare l'immagine di ciascun punto multiplo sul canale corrispondente all'anticorpo secondario utilizzato per la colorazione. Fare riferimento alle immagini dell'esecuzione di immagini dal vivo per assicurarsi di acquisire gli stessi punti.Utilizzando questa tecnica, l'infezione da rotavirus è stata visualizzata in un monostrato di hIO dopo aver assegnato un punteggio a questo monostrato. Per i ceppi ricombinanti di rotavirus che esprimono proteine fluorescenti, come mRuby, l'infezione è stata verificata durante l'imaging dal vivo. Mentre quando è stato utilizzato un ceppo che non esprime un marcatore, l'infezione è stata rilevata mediante immunofluorescenza dopo l'imaging.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Preparation of Human Intestinal Organoid Monolayers for Live Fluorescence Imaging

Preparazione di monostrati di organoidi intestinali umani per l'imaging a fluorescenza dal vivo

Viral Infection of Human Intestinal Organoid Monolayers for Live Fluorescence Imaging

Infezione virale di monostrati di organoidi intestinali umani per l'imaging a fluorescenza dal vivo