Para empezar, configura el microscopio de epifluorescencia. Antes de la toma de imágenes, precaliente la incubadora Stage Top a 37 grados centígrados y haga funcionar el dióxido de carbono humidificado en la cámara a 0,02 litros por minuto. A continuación, coloque el portaobjetos con monocapas infectadas en la cámara de la incubadora y selle la tapa.
Utilizando un objetivo de 20X bajo iluminación de campo claro, seleccione las coordenadas X e Y de los campos de visión dentro de la monocapa. Optimice los parámetros de imagen y adquiera una imagen utilizando una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros. Para minimizar la fototoxicidad, ajuste la fuente de luz al 50% de potencia con un tiempo de exposición de 50 milisegundos.
Asegúrese de que no haya píxeles saturados y ajústelos para detectar todo el rango dinámico del sensor de calcio fluorescente. Configure un bucle de imágenes y adquiera una imagen en cada coordenada X e Y seleccionadas en un bucle de un minuto, y una imagen en este bucle de forma continua. En el caso de los virus marcados con fluorescencia, adquiera una imagen en el canal apropiado cada 10 bucles.
Si utiliza virus no fluorescentes, realice la tinción aminofluorescente después de la obtención de imágenes. Primero, fije las monocapas con 100 microlitros de formaldehído. Después de la incubación, retire el fijador y enfríe con 100 microlitros de cloruro de amonio de 50 milimolares durante 10 minutos.
Después de eliminar el cloruro de amonio, permeabilizar las monocapas con 100 microlitros de Triton X-100 al 0,1% durante una hora a temperatura ambiente. Luego retire la solución, agregue 100 microlitros de solución de bloqueo e incube durante una hora. A continuación, retire la solución de bloqueo y añada 100 microlitros de anticuerpos primarios engañados en 1X PBS.
Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados con un suave balanceo. Después de la incubación, retire los anticuerpos primarios y lávese tres veces con 1X PBS. Por último, añadir 100 microlitros de anticuerpos secundarios conjugados fluorescentes engañados en 1X PBS.
Para evitar el fotoblanqueo, proteja la placa de la luz e incube durante dos horas a temperatura ambiente. Eliminar los anticuerpos secundarios después de la incubación y teñir las muestras con la solución de DAPI. A continuación, coloque las monocapas fijas en 100 microlitros de 1X PBS para obtener imágenes.
Vuelva a colocar el portaobjetos en la platina del microscopio. Vuelva a cargar las coordenadas X e Y de la ejecución de imágenes en vivo y obtenga imágenes de cada multipunto en el canal correspondiente al anticuerpo secundario utilizado para la tinción. Haga referencia a las imágenes de la ejecución de imágenes en directo para asegurarse de capturar los mismos puntos.
Utilizando esta técnica, se obtuvo una imagen de la infección por rotavirus en una monocapa de hIO después de puntuar esta monocapa. En el caso de las cepas recombinantes de rotavirus que expresan proteínas fluorescentes, como mRuby, se verificó la infección durante la obtención de imágenes en vivo. Mientras que cuando se utilizó una cepa que no expresa un marcador, la infección se detectó por inmunofluorescencia después de la toma de imágenes.